長期慢性酒精攝入對(duì)肝細(xì)胞性肝癌惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移趨勢的影響.pdf

1、一、研究背景：
　　肝癌是全世界第五位的常見癌癥，中國第三位的常見癌癥。肝細(xì)胞性肝癌（HCC）約占原發(fā)性肝癌90％以上，預(yù)后不良。死亡率與發(fā)病率一致性地很高。據(jù)統(tǒng)計(jì)每年有超過50萬新增肝癌患者，中國14個(gè)腫瘤登記處合計(jì)的肝癌發(fā)病率為30.3/10萬，卻占腫瘤致死原因的第3位。目前肝癌的病因及確切分子機(jī)制仍不完全清楚。多數(shù)流行病學(xué)調(diào)查表明在肝細(xì)胞性肝癌的主要危險(xiǎn)因素中，長期酒精攝入是一重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素，其研究也越來越受到科研人員的

2、重視。有充足的證據(jù)認(rèn)為酒精與包括肝臟在內(nèi)的所有消化道腫瘤和乳腺腫瘤的發(fā)生有關(guān)。另有許多流行病研究表明酒精與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，比如影響腫瘤從腺瘤發(fā)展到癌瘤，同樣也可能促進(jìn)患有高危性息肉的惡性生物學(xué)進(jìn)展。然而酒精對(duì)肝癌惡性發(fā)展的研究不多，其中的具體機(jī)制也未闡明。
　　血管發(fā)生是實(shí)體腫瘤生長和浸潤的先決條件。為生長超越微觀大小，原發(fā)性的腫瘤和微小轉(zhuǎn)移灶必須激活血管的發(fā)生。近業(yè)研究表明與腫瘤新生血管化的生物分子標(biāo)記如血管內(nèi)皮生長因子（VEG

3、F）等被證實(shí)在如口腔和口咽部腫瘤治療中提供了實(shí)用的預(yù)后信息，其刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖和增加血管通透性，促進(jìn)了腫瘤血管的生成。此外，炎癥性的腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用，其包括缺氧微環(huán)境的產(chǎn)生，促進(jìn)了血管發(fā)生和腫瘤的侵襲。近來認(rèn)為單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是血管形成的化學(xué)因子與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　活性氧分子（ROS）被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，其機(jī)制為氧化應(yīng)激引起的氧化損傷，炎癥和脂質(zhì)過氧化。ROS

4、和抗氧化劑之間的平衡對(duì)控制癌細(xì)胞的生長是非常重要的。如果這一平衡被打破，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激，其在腫瘤惡性發(fā)展具有決定性的作用。酒精損傷的一個(gè)重要特征是細(xì)胞內(nèi)的ROS水平增加，其是通過細(xì)胞色素P450酶的代謝產(chǎn)物引起的。大量研究證實(shí)，ROS和NF-κB之間存在密切關(guān)系：而NF-κB是非常重要核轉(zhuǎn)錄因子與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，被認(rèn)為是炎癥相關(guān)腫瘤的啟動(dòng)因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)。它的活化能促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因細(xì)胞粘附分子（ICA

5、M-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、金屬蛋白酶-9（MMP-9）等的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和粘附能力以及細(xì)胞周期與分化的調(diào)控；其還能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，促進(jìn)血管形成，與腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移等多個(gè)過程有關(guān)。
　　本實(shí)驗(yàn)的研究目的有二：一是通過流行病學(xué)觀察臨床肝細(xì)胞性肝癌患者飲酒情況，分析其與腫瘤臨床病理特征及腫瘤惡性生物學(xué)之間的相關(guān)性。二是通過體外內(nèi)的實(shí)驗(yàn)方法探討酒精刺激后對(duì)肝癌腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)展影響

6、。期望通過上述研究進(jìn)一步認(rèn)識(shí)酒精在肝癌腫瘤惡性進(jìn)展中的可能機(jī)制，為其治療提供新的思路和方法。
　　二、研究目的：
　　1.通過臨床病例資料觀察肝癌患者飲酒情況，分析飲酒與腫瘤病理特征及其惡性生物學(xué)之間的相關(guān)性。同時(shí)了解不同組別之間腫瘤組織VEGF和MCP-1的表達(dá)以及NF-κB通路活化情況來探討慢性飲酒在肝癌惡性發(fā)展中的可能作用。
　　2.在體內(nèi)建立小鼠飲酒模型，觀察酒精喂養(yǎng)對(duì)裸鼠HepG2移植瘤腫瘤的生長和肺部轉(zhuǎn)移情

7、況的影響；在體外實(shí)驗(yàn)中觀察酒精刺激對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力及血管生成的影響；并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　三、研究內(nèi)容：
　　第一部分慢性酒精攝入促進(jìn)原發(fā)性人肝細(xì)胞性肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移
　　取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年1～12月行手術(shù)切除肝癌且術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為肝細(xì)胞性肝癌的住院患者。術(shù)前患者均未接受任何抗癌治療，共52例肝癌組織標(biāo)本。對(duì)肝癌患者的飲酒情況資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并采用免疫組化的方法判斷C

8、D34，VEGF和MCP-1以及NF-κB的表達(dá)。
　　第二部分酒精刺激促進(jìn)肝癌腫瘤的惡性生物學(xué)進(jìn)展及作用機(jī)制
　　選4～5周齡的裸鼠分為2組：對(duì)照組和酒精組，每組各7只隨機(jī)分組。酒精組小鼠晝夜交替給予含2%無水乙醇的飲用水，對(duì)照組晝夜飲用普通飲用水。取生長狀態(tài)良好對(duì)數(shù)期生長的HepG2細(xì)胞，注射于裸鼠背部。每2天觀察小鼠腫瘤生長狀況，稱重，待腫瘤長出之后，每三天測量并計(jì)算腫瘤體積。待5周以后處死解剖小鼠，取出腫瘤組織送病理

9、HE染色和免疫組化檢測CD34、VEGF和MCP-1的表達(dá)，同時(shí)取出肺組織，觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
　　在體外實(shí)驗(yàn)中用終體積為0.2%酒精刺激培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞。分組為正常對(duì)照組和0.2%酒精組。采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平，Western blot法檢測胞漿和胞核NF-κB p65、IκBα和p-IκBα蛋白表達(dá)以及ERK和JNK信號(hào)通路的活化情況，RT-PCR和ELISA方法檢測VEGF和MCP-1的基因表達(dá)

10、和培養(yǎng)上清液蛋白含量。同時(shí)采用MTT方法、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell方法分別檢測酒精對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移/侵襲能力，在體外建立三維血管生成模型來觀察血管生成的情況。另外，為了評(píng)價(jià)NF-κB特異性抑制劑PDTC對(duì)肝癌移植腫瘤的生長情況，我們使用PDTC給裸鼠腹腔注射（100 mg/kg），每三天腹腔注射一次并計(jì)算腫瘤體積。
　　四、研究結(jié)果：
　　第一部分：
　　收集52例肝癌術(shù)后組織標(biāo)本，其中男性45例，女性7例，

11、年齡22～74歲，中位年齡50歲，平均年齡為49.8±12.1。從未飲酒28例，長期飲酒24例。與無飲酒史的肝癌患者相比較，飲酒史的肝癌患者中TNM分期惡化和門靜脈浸潤比率明顯升高(分別為76.9%vs35.9%,P=0.01,88.9%vs37.4%,P=0.014)。飲酒量在35～87.5 g酒精的中等量飲酒患者與無飲酒患者相比較，存在明顯的TNM分期惡性進(jìn)展和門靜脈浸潤的高危險(xiǎn)度，其的相對(duì)危險(xiǎn)度分別為16.67和33.7。有飲酒史

12、的肝癌患者生存時(shí)間與無飲酒史的肝癌相比，其一年生存率和三年生存率分別為75%vs57.15%和62.5%vs35.7%(P=0.021)。與肝硬化組和遠(yuǎn)隔的非癌肝臟組織相比，無飲酒的肝癌腫瘤組織微血管密度明顯升高(分別為42.6±4.82vs27.2±1.48和42.6±4.82vs16.2±4.43,P均<0.01)，而在飲酒史的肝癌腫瘤組織中表達(dá)最高(61.0±6.78)。與無飲酒史的肝癌相比，VEGF/VEGFR-2和MCP-1/

13、CCR2的表達(dá)在飲酒史患者中明顯升高。在肝癌組織中NF-κB呈強(qiáng)陽性表達(dá)，主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)，呈淡黃色至棕褐色的顆粒狀物質(zhì)。與無酒精攝入史的肝癌患者相比，有飲酒史患者的肝癌組織中胞漿和胞核NF-κB的染色更深。
　　第二部分：
　　建立起小鼠飲酒動(dòng)物模型并成功復(fù)制出人肝細(xì)胞性肝癌移植成瘤模型。2%酒精組移植瘤重量明顯高于飲水對(duì)照組，其重量分別為0.95±0.1 g和0.38±0.03 g，兩組別間P值<0.05。

14、酒精組肺轉(zhuǎn)移率明顯高于正常對(duì)照。酒精組小鼠移植瘤里微血管明顯豐富于飲水對(duì)照組。形態(tài)學(xué)測定量化分析兩組的微血管密度分別為64.6±8.92 vs34.3±3.83，其 P值<0.05。在24和48 h時(shí)相點(diǎn)酒精刺激后兩組別之間的HepG2細(xì)胞增殖能力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell方法顯示，劃痕后培養(yǎng)12、24和48h時(shí)相點(diǎn)酒精明顯加速了HepG2細(xì)胞向中央劃痕區(qū)的遷移能力和從上室向下室的遷移能力。在體外利用HepG2細(xì)胞建

15、立3-D腫瘤細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，其結(jié)果顯示在HUVEC單獨(dú)培養(yǎng)系統(tǒng)中平均出芽率27.3%，而在HUVEC與HepG2共培養(yǎng)系統(tǒng)中平均出芽率為42.9%。另外，在HUVEC與HepG2共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與培養(yǎng)基對(duì)照相比，加入0.2%酒精刺激后，其平均出芽率為67.9%，兩組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。0.2%酒精刺激HepG2細(xì)胞后，其VEGF和MCP-1 mRNA的水平較對(duì)照組明顯升高，且呈時(shí)間依賴性。而酒精刺激12、24和48

16、 h后的培養(yǎng)上清液里VEGF和MCP-1蛋白含量同樣也明顯高于對(duì)照組。在體外實(shí)驗(yàn)中0.2%的酒精刺激30 min后HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的相對(duì)水平為8.54±1.32，而其正常對(duì)照組ROS的相對(duì)水平為1.37±0.36，兩組間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。酒精刺激后HepG2細(xì)胞胞漿P65蛋白較對(duì)照組明顯降低，而胞核內(nèi)的 P65蛋白表達(dá)水平較胞漿明顯升高。抑制蛋白 IκBα的表達(dá)在酒精刺激后明顯下調(diào)，而其磷酸化水平蛋白明顯上調(diào)。0

17、.2%酒精刺激后HepG2細(xì)胞內(nèi)磷酸化的ERK和JNK明顯高于對(duì)照PBS刺激組，且隨著時(shí)間，在酒精刺激24 h達(dá)到最高峰，而總的ERK蛋白水平?jīng)]有明顯變化。另外，在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中酒精組移植瘤的VEGF和MCP-1的表達(dá)明顯高于飲水對(duì)照組和PDTC組。而酒精+PDTC用藥組與酒精組相比，VEGF和MCP-1的表達(dá)明顯下調(diào)且腫瘤呈現(xiàn)明顯緩解的生長速度。
　　五、研究結(jié)論：
　　1.通過臨床資料研究初步揭示了長期慢性中等量的酒精攝

18、入明顯增加了肝癌患者的腫瘤惡性進(jìn)展。另外，酒精可能通過活化NF-κB信號(hào)通路上調(diào)VEGF和MCP-1表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移。
　　2.成功建立了模擬人類慢性飲酒環(huán)境的小鼠腫瘤模型。酒精促進(jìn)裸鼠肝癌移植瘤肝癌腫瘤血管的生成，加速腫瘤的生長以及肺部轉(zhuǎn)移能力。在體外證實(shí)了酒精刺激后可增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的遷移能力以及促進(jìn)新生血管的生成，并可能通過氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo) NF-κB信號(hào)通路的活化并依賴于VEGF和MCP-1的高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致一