Ezrin在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及吳茱萸硬堿對人肝癌細(xì)胞株HepG2 Ezrin生物學(xué)行為的影響.pdf

1、第一章、肝細(xì)胞癌組織中Ezrin和CD44表達(dá)的相關(guān)性研究
　　目的:了解Ezrin蛋白、CD44蛋白與肝細(xì)胞癌臨床病理特征、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法:本研究應(yīng)用免疫組化法(SP法)檢測Ezrin蛋白、CD44蛋白在70例肝癌的表達(dá)情況，并對它們在病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的不同表達(dá)進(jìn)行對比分析。
　　結(jié)果:
　　1、Ezrin蛋白、CD44蛋白定位于細(xì)胞漿;
　　2、Ezrin蛋白在有淋

2、巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌中陽性率(97.67％)顯著高于無轉(zhuǎn)移者(74.07％)(P＜0.05)，提示Ezrin蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。與患者年齡，性別，腫瘤大小無關(guān)均無顯著相關(guān)性;
　　3、CD44蛋白陽性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性(P＜0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(100％)的陽性率要顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(81.48％)的陽性率。與臨床分期無顯著相關(guān)性;
　　4、在肝細(xì)胞肺癌中，Ezrin蛋白與CD44蛋白陽性表達(dá)呈正相關(guān)

3、(P＜0，05)。
　　結(jié)論:
　　1、Ezrin蛋白和CD44在肝癌組織中高表達(dá)，兩者表達(dá)呈正相關(guān);
　　2、Ezrin蛋白在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與TNM分期和病理分級有關(guān)，與有無復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與其他因素均不相關(guān);
　　3、CD44在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與與肝癌轉(zhuǎn)移與否有關(guān)，而與其他因素均不相關(guān);
　　4、聯(lián)合檢測Ezrin和CD44的表達(dá)有助于綜合判斷肝癌的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能，為基因靶向治療提供理論依據(jù)。<

4、br>　　第二章、特異性下調(diào)Ezrin對肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制
　　目的:應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)Ezrin在肝癌細(xì)胞株HepG2中的表達(dá)，探討Ezrin在肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制。
　　方法:通過siRNA技術(shù)特異性下調(diào)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株HepG2中Ezrin的表達(dá)，應(yīng)用Transwell法和劃痕法對肝細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移能力的改變進(jìn)行分析;應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測E-鈣鉆素，N-鈣鉆素

5、和波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。應(yīng)用細(xì)胞黏附實驗和細(xì)胞伸展實驗觀察特異性下調(diào)Ezrin對細(xì)胞黏附特性和細(xì)胞極性形成的影響;應(yīng)用明膠酶譜實驗檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性;用免疫印跡實驗檢測細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達(dá)及磷酸化狀態(tài)。
　　結(jié)果:
　　1、Transwell實驗顯示Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞每個低倍視野細(xì)胞數(shù)平均為33.8個，明顯

6、低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞（平均77.6個/低倍視野）和非特異性siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞（平均78.7個/低倍視野），統(tǒng)計學(xué)分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)。這表明特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝細(xì)胞癌的侵襲。劃痕法實驗結(jié)果顯示，24h后Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的創(chuàng)口愈合較慢(43.8％)，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(94.2％)和非特異性SIRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(89.2％)創(chuàng)口基本愈合。統(tǒng)計學(xué)分析表明具有顯著差異(P＜0.05);
　　2、免疫沉淀實驗結(jié)

7、果表明，在Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Src的磷酸化水平明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著差異(P＜0.05);免疫印跡實驗結(jié)果表明在Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，Src的表達(dá)沒有差異(P＞0.05)。以上結(jié)果表明特異性下調(diào)Ezrin表達(dá)可以抑制Src的磷酸化。在Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中N-黏鈣素、波形蛋白的表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而E-黏鈣素的表達(dá)明

8、顯高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著差異(P＜0.05);
　　3、應(yīng)用細(xì)胞伸展實驗對Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的極性形成進(jìn)行研究，結(jié)果表明在不同時間點(diǎn)Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的伸展明顯落后于非特異性RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(P＜0.05)。應(yīng)用明膠酶譜技術(shù)和免疫印跡技術(shù)對Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)與活性進(jìn)行檢測，明膠酶譜的實驗結(jié)果顯示Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞M

9、MP-2、MMP-9的活性明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞;免疫印跡實驗結(jié)果表明Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)明顯低于非特異性轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄因子c-jun的表達(dá)及磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Ezrin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，c-jun的磷酸化水平明顯降低，而c-jun的表達(dá)沒有變化。
　　結(jié)論:
　　1、特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，這種作用是通

10、過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和參與Src信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的;
　　2、特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝癌細(xì)胞的黏著斑轉(zhuǎn)換、細(xì)胞極性形成和細(xì)胞外基質(zhì)的降解;Ezrin可作為肝細(xì)胞癌治療的一個重要靶點(diǎn)。
　　第三章、吳茱萸堿對人肝癌HepG2 Ezrin表達(dá)和生物學(xué)行為的影響
　　目的:觀察吳茱萸堿對HepG2細(xì)胞Ezrin表達(dá)的影響，探討吳茱萸堿抗腫瘤作用的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1、用MTT法觀察吳茱萸堿對

11、HepG2細(xì)胞增殖的影響;
　　2、用集落形成法觀察吳茱萸堿對細(xì)胞集落形成的影響;
　　3、通過劃痕試驗及transwell細(xì)胞侵襲試驗進(jìn)一步對吳茱萸堿作用的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力進(jìn)行分析;
　　4、并用Western Blot和RT-PCR檢測吳茱萸堿干預(yù)后腫瘤細(xì)胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1、吳茱萸堿抑制HepG2細(xì)胞增殖，呈時間和劑量依賴關(guān)

12、系，吳茱萸堿作用48小時，IC50約為37.283μM;
　　2、吳茱萸堿影響HepG2細(xì)胞的集落形成，呈量效關(guān)系;
　　3、細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明藥物治療后肝癌細(xì)胞增殖遷移能力受到明顯抑制;
　　4、Western Blot和RT-PCR結(jié)果顯示，吳茱萸堿明顯降低Ezrin、磷酸化Ezrin及EzrinmRNA在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、吳茱