重組質粒載體和禽腺聯病毒介導的miRNA抑制IBDV復制研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種雞的高度接觸性傳染病，除引起雞死亡和生產性能下降，還可導致感染雞的免疫抑制和其它疫苗接種的免疫失敗。IBD呈世界范圍流行，尤其是近年來超強毒株和抗原變異株的出現，使得常規(guī)疫苗的免疫效果明顯下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成的危害越來越大，迫切需要更為有效的新型防制措施。

2、 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來快速發(fā)展的一種轉錄后基因沉默技術，在功能基因組研究、腫瘤治療和抗病毒感染等方面具有良好的應用前景，已被證明能抑制幾乎所有種屬病毒的復制。為探索用RNAi技術抑制IBDV復制的可行性，本研究在比較不同來源RNA聚合酶啟動子轉錄活性基礎上，選用禽源U6啟動子構建短干擾RNA(short interference RNA，siRNA)表達載體，以綠色熒光蛋白(green

3、fluorescent protein，GFP)基因為報告基因，證明在禽源細胞中能成功實現特異基因表達沉默；進而用專業(yè)軟件預測IBDV VP2基因特異性siRNlA，將人工合成的微小RNA(microRNA，miRNA)插入表達載體，以細胞轉染法篩選出2個有效抑制IBDV VP2基因表達的miRNA，將其克隆入含neo基因的表達載體，經G418篩選獲得抗性細胞克隆，用感染試驗證明能顯著抑制IBDV復制；最后將miRNA表達盒插入禽腺聯病

4、毒(avian adeno-associated vires，AAAV)轉移載體，用重組病毒感染細胞進行的試驗結果證明，表達的miRNA對IBDV復制不僅具有更為顯著的抑制作用，而且對異源毒株復制也有類似的抑制效果，為IBD防制研究開辟了新的途徑，現將試驗結果總結如下。 目前siRNA表達試驗多用人或鼠源H1或U6啟動子在哺乳動物細胞中進行，對于這些啟動子能否在禽細胞中有效轉錄短發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,s

5、hRNA)或miRNA仍有爭議。我們利用siDirect軟件預測GFP基因特異性siRNA，將人工合成的相應shRNA插入含人H1啟動子的pSuper載體，獲得重組載體pSupcr-shRNA;再將shRNA表達盒插入含GFP基因的pEGFP-N1載體，獲得重組載體pGFP-H1-shRNA。分別以pEGFP-N1、pSuper-shRNA+pEGFP-N1和pGFP-H1-shRNA轉染哺乳動物源COS-1、293-T細胞和禽源雞胚肝

6、(CEL)、雞胚成纖維(CEF)細胞，根據相同條件下轉染細胞培養(yǎng)中熒光陽性細胞數及熒光強度的變化，比較人H1啟動子在哺乳動物源和禽源細胞中轉錄shRNA的效率。結果顯示，人H1啟動子在哺乳動物細胞中能有效轉錄shRNA，但在禽源細胞中的轉錄效率很低。這些試驗結果表明，開展禽源細胞siRNA表達研究應選用禽源啟動子。為了開展禽源細胞RNAi研究，以含雞U6啟動子的pRFPRNAiC為miRNA表達載體，用Genscript軟件預測GFP序

7、列特異性siRNA，從10個潛在的siRNA中隨機選擇1個siRNA序列，用PCR合成雙鏈寡核苷酸，將其插入表達載體pRFPRNAiC，用獲得的重組載體pRFPRNAiGFP與報告質粒pEGFP-N1共轉染COS-1、293-T、CEL和CEF細胞，根據相同條件下GFP陽性細胞數及熒光強度變化，比較哺乳動物和禽細胞中雞U6啟動子表達miRNA的效率。結果顯示，pRFPRNAiGFP在哺乳動物和禽源細胞中都能表達抑制性miRNA，在禽源細

8、胞中轉錄效率較高。這些試驗結果表明，源禽U6啟動子轉錄miRNA的細胞種屬特異性相對較弱，pRFPRNAiC載體可用于禽源細胞的miRNA表達研究。 為了探索用RNAi技術抑制IBDV復制的可行性，利用Genscript軟件預測針對IBDV VP2基因的siRNA，從1O個潛在的siRNA中選擇5個siRNA序列，將PCR產生的雙鏈寡核苷酸插入pRFPRNAiC載體，獲得重組載體pRFPRNAmiVP2A，pRFPRNAmiVP

9、2B，pRFPRNAmiVP2C，pRFPRNAmiVP2D、pRFPRNAmiVP2E；根據IBDV Lukert株VP2基因序列設計引物，用PCR擴增不含自身翻譯終止碼的VP2基因，將擴增產物與pEGFP-N1載體中GFP基因的N端融合，獲得報告載體pVP2-GFP。分別將5個miRNA表達載體與報告載體共轉染DF-1細胞，在轉染后24 h用Northern Dot Blotting確認miRNA表達，然后分別用熒光共聚焦顯微鏡和流

10、式細胞術對轉染細胞培養(yǎng)中的熒光陽性細胞數及熒光總量進行定性和定量分析。結果與報告載體單獨轉染細胞相比，5個miRNA表達載體與報告載體共轉染細胞的熒光抑制效率在59.7％-78.5％之間；將抑制效果較好的miVP2A和miVP2E表達盒分別克隆入含neo基因的pTarget載體，用獲得的重組載體轉染DF-1細胞，經G418篩選后獲得抗性細胞，用IBDV Lurket感染，感染三天后用半定量RT-PCR測定VP2基因表達，并測定IBDV半

11、數組織細胞感染劑量(TCID50)。結果顯示，miVP2A和miVP2E表達細胞中VP2基因表達抑制率分別為80.7％和75.0％，TCID50分別下降6和5lgs。這些試驗結果表明，針對VP2基因的兩個miRNA對IBDV基因表達和復制均有顯著的抑制作用。利用重組AAAV穩(wěn)定表達外源基因的特點，用限制酶消化法去除含AAAV全基因組質粒載體pCR-AAAV中的Rep和Cap蛋白編碼序列，獲得AAAV轉移載體pAITR：分別將miVP2E

12、和針對VP1基因的miVP1表達盒連同紅色熒光蛋白(redfluorescent protein，RFP)基因表達盒插入pAITR中左、右ITR之間，分別用獲得的重組載體pAITR-RFP-miVP2E和pAITR-RFP-miVP1與AAAV包裝載體pcDNA-ARC及腺病毒輔助載體pHelper共轉染AAV-293細胞，經PCR檢測證明獲得的rAAAV中含有miRNA表達盒，純化rAAAV感染性滴度為8×108TU／ml：用rAAA

13、V轉導DF-1細胞，轉導后48 h用3株IBDV感染，感染后不同時間用TCID50測定法檢測感染性病毒，用半定量RT-PCR檢測病毒基因表達，。結果顯示，在IBDV Lukert株感染后96 h，miVP2E和miVP1表達細胞中VP2基因表達抑制率分別為85.2％和89.6％，TCID50分別下降6和7lgs；用另兩株IBDV感染miVP2E和miVP1表達細胞，感染性病毒測定結果顯示，miVP2E表達細胞中2株IBDV的TCID50