EBV潛伏膜蛋白LMP2A誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞EMT及增加側(cè)群細(xì)胞群體的研究.pdf

1、鼻咽癌在西方國(guó)家的發(fā)病率為1/100000，在中國(guó)廣東省的發(fā)病率高達(dá)30/100000，研究表明其發(fā)病因素主要有遺傳因素、環(huán)境因素及EB病毒感染。EBV屬于人類(lèi)Y皰疹病毒，廣泛分布于全球。EB病毒潛伏感染存在于所有的未分化鼻咽癌患者中，并以潛伏感染存在，主要表達(dá)潛伏膜蛋白I(LMPl)、EB病毒核抗原(EBNAl)及EBV編碼的小RNA(EBERs)以及表達(dá)潛伏膜蛋白2(LMP2)。其中LMPI基因?yàn)椴《景┗?，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄核因子-KB

2、(NF-KB)、激活蛋白1以及Janus蛋白激酶，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子信號(hào)傳導(dǎo)通路而致瘤。但是在鼻咽癌標(biāo)本中，LMP1在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量只有35％和65％，而LMP2A在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量高達(dá)50％和95％，由此可見(jiàn)，LMP2A在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有極其重要的作用。
　　 研究方法
　　 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法建立穩(wěn)定表達(dá)LMP2A的鼻咽上皮細(xì)胞株，RT-PCR、WesternBlot檢測(cè)LMP2A的表達(dá)，

3、免疫熒光方法檢測(cè)LMP2A的亞細(xì)胞定位；Western Blot、免疫熒光檢測(cè)EMT分子標(biāo)志物的表達(dá)情況；劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力；平板克隆、軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力；SP流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞的SP細(xì)胞含量；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力。
　　 研究結(jié)果
　　 1.穩(wěn)定高表達(dá)LMP2A增強(qiáng)鼻咽上皮細(xì)胞的遷移侵襲能力
　　 利用逆轉(zhuǎn)錄病毒方法建立了穩(wěn)定表達(dá)LMP2

4、A的鼻咽上皮細(xì)胞株，RT-PCR及Western Blot方法證明了LMP2A的穩(wěn)定表達(dá)，免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了細(xì)胞的業(yè)定位狀態(tài)。通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，在鼻咽上皮細(xì)胞CNE2、SUNE1穩(wěn)定高表達(dá)LMP2A之后，細(xì)胞的遷移侵襲能力大大增強(qiáng)。
　　 2.LMP2A誘導(dǎo)鼻咽上皮細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象
　　 通過(guò)Western Blot及免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示，穩(wěn)定高表達(dá)LMP2A之后，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadher

5、in、Q-catenin明顯降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Fibronectin、Vimentin明顯升高，即穩(wěn)定高表達(dá)LMP2A之后，鼻咽上皮細(xì)胞CNE2、SUNE1發(fā)生了EMT相關(guān)的分子改變。
　　 3.LMP2A上調(diào)干細(xì)胞分子標(biāo)志物的表達(dá)
　　 RT-PCR及Western Blot顯示穩(wěn)定高表達(dá)了LMP2A之后，ABCG2、Nanog、SOX2、OCT4表達(dá)明顯升高。SP流式細(xì)胞分析實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)染了LMP2A之后，其SP

6、含量大大增加，鼻咽上皮細(xì)胞CNE2、SUNE1中SP含量分別從5％、1.1％升高到了20.9％、7.8％。
　　 4.LMP2A增強(qiáng)鼻咽上皮細(xì)胞的體外克隆形成能力及體內(nèi)成瘤能力
　　 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定高表達(dá)LMP2A之后，形成的克隆數(shù)目、克隆大小都比對(duì)照大大增加，由此表明LMP2A大大增強(qiáng)鼻咽上皮細(xì)胞的克隆形成能力。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定表達(dá)LMP2A的細(xì)胞無(wú)論在成瘤率還是腫瘤牛長(zhǎng)速度都大大超過(guò)

7、了對(duì)照細(xì)胞，這種差異隨著種入細(xì)胞的逐漸減少而更加明顯，尤其在1×103的時(shí)候，差異最明顯。結(jié)果表明LMP2A可以大大增強(qiáng)鼻咽上皮細(xì)胞的腫瘤形成能力。
　　 5.LMP2A在鼻咽癌標(biāo)本中的表達(dá)水平與ABCG2的表達(dá)呈高度相關(guān)性。
　　 我們收集了35例鼻咽標(biāo)本，其中包括15例鼻咽炎癥標(biāo)本和20例鼻咽癌標(biāo)本。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)，LMP2A在鼻咽炎癥標(biāo)本中的低或無(wú)表達(dá)，但在大多數(shù)鼻咽癌中高表達(dá)，ABCG2的表達(dá)與LMP2A

8、的表達(dá)一致(相關(guān)系數(shù)為0.95，P值<0.0001)，具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，通過(guò)裸鼠移植瘤及2例鼻咽標(biāo)本的免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，LMP2A與ABCG2的表達(dá)定位具有棚似性，二者具有高度相關(guān)性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　 1.LMP2A能夠增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵袋能力及成瘤能力；
　　 2.LMP2A能夠誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象；
　　 3.LMP2A可以上調(diào)鼻咽癌細(xì)胞腫瘤于細(xì)胞樣細(xì)胞群體；