大腸桿菌K-12對消毒劑耐受和抗生素耐藥相關(guān)外膜蛋白組學(xué)的研究.pdf

1、采用蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)研究方法，對革蘭氏陰性病原菌大腸桿菌K-12的外膜蛋白進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，重點(diǎn)篩選和鑒定了與消毒劑耐受和抗生素耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)組，并對這些差異外膜蛋白進(jìn)行驗(yàn)證和一系列的功能研究，有助于了解細(xì)菌對消毒劑耐受和對抗生素耐藥的機(jī)制，這對于尋找新藥物靶點(diǎn)和研制新的抗菌藥物或疫苗具有重要的意義。 通過對多種消毒劑的蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行分析，成功地在大腸桿菌K-12中分別鑒定出與異丙醇(7種)、乙醇(7種)和苯酚(5種)耐

2、受相關(guān)的外膜蛋白，并發(fā)現(xiàn)異丙醇與乙醇耐受相關(guān)外膜蛋白一致，均為Tsx、OmpC、OmoF、FadL、OmpT、OmpA和LamB，其中FadL、OmpT、OmpA、LamB4種外膜蛋白是三者所共有的。在對這些結(jié)果進(jìn)行Westernblotting證實(shí)的基礎(chǔ)上，采用基因敲除菌株、補(bǔ)救菌株和高表達(dá)菌株進(jìn)一步進(jìn)行消毒劑耐受試驗(yàn)，證明了LamB、OmpC和OmpA是大腸桿菌K-12對醇類消毒劑耐受相關(guān)最重要的外膜蛋白；LamB、OmpA和Omp

3、T是大腸桿菌K-12對苯酚耐受相關(guān)的重要外膜蛋白，尤其以O(shè)mpA和OmpT為著。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，大腸桿菌K-12對這三種消毒劑的耐受還受EnvZ/OmpR雙成分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。這些結(jié)果均顯示外膜蛋白在革蘭氏陰性細(xì)菌對消毒劑耐受中起到重要作用，其特征與消毒劑種類有關(guān)。 通過亞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究大腸桿菌K-12對四環(huán)素和卡那霉素耐藥相關(guān)的功能外膜蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在四環(huán)素耐藥菌株中共有11個差異點(diǎn)，其中有8個點(diǎn)為外膜蛋白，屬于6種外

4、膜蛋白，分別為LamB、FimD、TolC、OmpC、Tsx和OmpW；在卡那霉素耐藥菌株的11個差異蛋白點(diǎn)中，有9個點(diǎn)為外膜蛋白，共為7種外膜蛋白，它們是OmpA、Tolc、FadL、OstA、Tsx、OmpW和MipA。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，TolC、Tsx和OmpW為2種抗生素耐藥菌株共同變化的外膜蛋白，Westernblotting結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了2-DE結(jié)果的可靠性。在此基礎(chǔ)上，對這些外膜蛋白進(jìn)行了較深入的功能分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌

5、K-12對四環(huán)素耐藥過程中，LamB、TolC和OmpC這3個外膜蛋白發(fā)揮重要作用；在大腸桿菌K-12對卡那霉素耐藥過程中，MipA和TolC是特別重要的外膜蛋白，其中關(guān)于MipA是細(xì)菌耐藥相關(guān)外膜蛋白的報道在國內(nèi)外尚屬首次。 采用功能基因組學(xué)的方法，構(gòu)建了兩株分別含有TolC長、短片段胞外結(jié)構(gòu)域突變的突變株△tolC—pET-28a—tolCl和△tolC—pET-28a—tolC2，并通過耐藥實(shí)驗(yàn)證明了TolC除了具有藥物外