大腸桿菌K-12對消毒劑耐受和抗生素耐藥相關外膜蛋白組學的研究.pdf

1、采用蛋白質組學和基因組學研究方法，對革蘭氏陰性病原菌大腸桿菌K-12的外膜蛋白進行了較系統(tǒng)的研究，重點篩選和鑒定了與消毒劑耐受和抗生素耐藥相關的蛋白質組，并對這些差異外膜蛋白進行驗證和一系列的功能研究，有助于了解細菌對消毒劑耐受和對抗生素耐藥的機制，這對于尋找新藥物靶點和研制新的抗菌藥物或疫苗具有重要的意義。 通過對多種消毒劑的蛋白質組學進行分析，成功地在大腸桿菌K-12中分別鑒定出與異丙醇(7種)、乙醇(7種)和苯酚(5種)耐

2、受相關的外膜蛋白，并發(fā)現(xiàn)異丙醇與乙醇耐受相關外膜蛋白一致，均為Tsx、OmpC、OmoF、FadL、OmpT、OmpA和LamB，其中FadL、OmpT、OmpA、LamB4種外膜蛋白是三者所共有的。在對這些結果進行Westernblotting證實的基礎上，采用基因敲除菌株、補救菌株和高表達菌株進一步進行消毒劑耐受試驗，證明了LamB、OmpC和OmpA是大腸桿菌K-12對醇類消毒劑耐受相關最重要的外膜蛋白；LamB、OmpA和Omp

3、T是大腸桿菌K-12對苯酚耐受相關的重要外膜蛋白，尤其以OmpA和OmpT為著。進一步實驗顯示，大腸桿菌K-12對這三種消毒劑的耐受還受EnvZ/OmpR雙成分調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。這些結果均顯示外膜蛋白在革蘭氏陰性細菌對消毒劑耐受中起到重要作用，其特征與消毒劑種類有關。 通過亞蛋白質組學技術，研究大腸桿菌K-12對四環(huán)素和卡那霉素耐藥相關的功能外膜蛋白。結果發(fā)現(xiàn)，在四環(huán)素耐藥菌株中共有11個差異點，其中有8個點為外膜蛋白，屬于6種外

4、膜蛋白，分別為LamB、FimD、TolC、OmpC、Tsx和OmpW；在卡那霉素耐藥菌株的11個差異蛋白點中，有9個點為外膜蛋白，共為7種外膜蛋白，它們是OmpA、Tolc、FadL、OstA、Tsx、OmpW和MipA。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，TolC、Tsx和OmpW為2種抗生素耐藥菌株共同變化的外膜蛋白，Westernblotting結果進一步證實了2-DE結果的可靠性。在此基礎上，對這些外膜蛋白進行了較深入的功能分析。結果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌

5、K-12對四環(huán)素耐藥過程中，LamB、TolC和OmpC這3個外膜蛋白發(fā)揮重要作用；在大腸桿菌K-12對卡那霉素耐藥過程中，MipA和TolC是特別重要的外膜蛋白，其中關于MipA是細菌耐藥相關外膜蛋白的報道在國內(nèi)外尚屬首次。 采用功能基因組學的方法，構建了兩株分別含有TolC長、短片段胞外結構域突變的突變株△tolC—pET-28a—tolCl和△tolC—pET-28a—tolC2，并通過耐藥實驗證明了TolC除了具有藥物外