KGFR腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在LPS所致肺泡上皮細(xì)胞損傷修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是伴有嚴(yán)重呼吸功能障礙的一個(gè)復(fù)雜多變的過程.治療和減輕ALI對(duì)機(jī)體的損害,降低死亡率,一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn).目前在傳統(tǒng)的ALI治療基礎(chǔ)之上,對(duì)ALI的基因治療也取得了一些進(jìn)展.適合于ALI基因治療的目的基因分為抗氧化劑編碼基因、抗炎基因、保護(hù)和維持肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能的基因、抑制ARDS纖維化增生的基因等幾類.該研究取得的結(jié)果如下:(1)通過LPS造成小鼠急性肺損傷模型和Ⅱ

2、型肺泡上皮細(xì)胞(A549)細(xì)胞損傷模型;運(yùn)用PCR和FQ-PCR觀察急性肺損傷時(shí)小鼠肺部組織和A549細(xì)胞的KGFR mRNA變化情況,明確了急性肺損傷時(shí)KGFR的變化規(guī)律.(2)提取正常小鼠肺組織RNA,通過RT-PCR構(gòu)建小鼠FGFR2的exon3~exon11片段;將該片段裝入TA-Cloning中擴(kuò)增,通過酶切和PCR篩選含有exon8的FGFR2 exon3~exon11片段;再將含有exon8的FGFR2 exon3~exo

3、n11片段置換pSK-FGFR2-Ⅲc質(zhì)粒中含有exon9的FGFR2 exon3~exon11片段,從而形成含exon8的pSK-FGFR2-Ⅲb質(zhì)粒(FGFR2-Ⅲb即KGFR);(3)擴(kuò)增pSK-FGFR2-Ⅲb質(zhì)粒并將FGFR2-Ⅲb裝入pAdTrack-CMV質(zhì)粒中,形成pAdTrack-FGFR2-Ⅲb質(zhì)粒,再將pAdTrack-FGFR2-Ⅲb質(zhì)粒與AdEasy-1腺病毒進(jìn)行同源重組,形成AdEasy-FGFR2-Ⅲb腺病

4、毒DNA;(4)AdEasy-FGFR2-Ⅲb腺病毒DNA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,合成為AdEasy-FGFR2-Ⅲb腺病毒,大量擴(kuò)增AdEasy-FGFR2-Ⅲb腺病毒并鑒定其效價(jià);再將大量擴(kuò)增獲得的AdEasy-FGFR2-Ⅲb腺病毒感染A549細(xì)胞(即小鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞)觀察轉(zhuǎn)基因效果.(5)通過SDS-PAGE及Western-Blot鑒定KGFR表達(dá)情況.結(jié)果顯示,小鼠肺組織KGFR的表達(dá)在急性肺損傷時(shí)有下降趨勢(shì);通過腺病毒轉(zhuǎn)