香煙煙霧提取物致肺泡上皮細(xì)胞損傷作用的研究.pdf

1、慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是全球范圍內(nèi)呼吸系統(tǒng)疾病中發(fā)病率和死亡率居于前位的疾病，并且其發(fā)病還呈蔓延之勢(shì)。明晰該病的病因和發(fā)病機(jī)理對(duì)于找到有效的預(yù)防和治療對(duì)策是十分重要的。已知吸煙是導(dǎo)致COPD的主要病因，香煙煙霧(cigarettesmoke，CS)是一種富含氧化劑成份的復(fù)雜的混合物，在構(gòu)成肺臟的多種細(xì)胞類型中，肺泡上皮細(xì)胞是遭受CS中氧化劑損傷的主要部位。Ⅰ型上皮

2、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，一旦損傷，就必須依賴于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖才能得到補(bǔ)充。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞是肺泡上皮的干細(xì)胞，在受到氧化損傷以后，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖啟動(dòng)速度的快慢對(duì)損傷的及時(shí)修復(fù)具有決定性作用。因此，有關(guān)香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)理的研究就顯得尤為重要。另外，包括視黃醇和維生素A酸(retinoicacid，RA)在內(nèi)的類維生素A，曾被報(bào)道參與肺損傷

3、的修復(fù)。然而，對(duì)于RA是否參與調(diào)節(jié)受CSE誘導(dǎo)的的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的增殖還從未被研究過。除了RA，還有一種可以作為合成谷胱甘肽前體的抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，雖已被用于COPD患者的治療以減輕癥狀，阻止病情惡化和肺功能的加速下降，但其在逆轉(zhuǎn)CSE所誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)理仍需要進(jìn)一步研究。 基于以上分析，本實(shí)驗(yàn)研究了CSE對(duì)人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長的影響，以

4、及全反式維生素A酸(all-transretinoicacid，ATRA)和NAC對(duì)CSE的拮抗作用，并探討了與此相關(guān)的分子機(jī)制。運(yùn)用相差顯微鏡觀察到CSE作用后細(xì)胞生長密度減低，漂浮細(xì)胞增多，尚貼壁細(xì)胞也呈回縮變圓的態(tài)勢(shì)，細(xì)胞之間空隙加大，細(xì)胞折光性變?nèi)?，輪廓增?qiáng)，且胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)增多。通過MTT比色法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CSE對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的這種生長抑制呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性，且以流式細(xì)胞術(shù)手段證實(shí)受抑制細(xì)胞的生長是被阻止在了G1期。而AT

5、RA和NAC則能拮抗CSE對(duì)肺泡上皮細(xì)胞的此種抑制作用。在以上變化的基礎(chǔ)上，通過Hoechst33258染色以及透射電鏡的手段還觀察到了核濃縮，染色質(zhì)凝集，邊集，胞漿內(nèi)空泡增多，細(xì)胞表面微絨毛消失等凋亡相關(guān)的形態(tài)學(xué)變化；經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳和AnnexinV-FITC/碘化丙錠雙染法檢測(cè)到了凋亡相關(guān)的生化特征，即DNA的片斷化以及磷脂酰絲氨酸的外翻；并以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)到了膜表面Fas受體的高表達(dá)以及在凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的ca

6、spase家族成員之一caspase-3的顯著活化。從而證實(shí)CSE確能誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，在運(yùn)用H2DCFDA染色后觀察到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)在細(xì)胞受到CSE刺激以后得到了快速而大量的積累，而ATRA和NAC能減低之。從而提示ROS在CSE所致肺泡Ⅱ細(xì)胞損傷過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用。為了更深入的探討CSE致?lián)p傷以及RA和NAC抗損傷的具體機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)中還運(yùn)用半定量和實(shí)時(shí)

7、定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)到單獨(dú)使用CSE干預(yù)以及CSE聯(lián)合ATRA干預(yù)以后肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)p21WAF1，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1)，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2(insulin-lkegrowthfactorbindingprotein-2，IGFBP-2)，

8、以及cyclinEmRNA的表達(dá)在CSE單獨(dú)作用組要明顯高于聯(lián)合作用組，p＜0.05。而對(duì)CDK2(cyclin-dependentkinase2，CDK2)mRNA的表達(dá)卻又有著相反的影響；運(yùn)用免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法等手段檢測(cè)到同轉(zhuǎn)錄水平相一致，p21WAF1，TGF-β1，IGFBP在蛋白水平的表達(dá)在CSE單獨(dú)作用組也是明顯高于聯(lián)合作用組的，p＜0.05。但是，在CSE作用后，p53的表達(dá)在蛋白和核酸水平均未觀察到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的

9、變化。另外，還發(fā)現(xiàn)NAC對(duì)受CSE誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞中IGFBP-2的表達(dá)具有和RA相同但更為強(qiáng)大的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，從本實(shí)驗(yàn)中能夠得出如下結(jié)論：CSE能抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的生長且使其細(xì)胞周期阻滯于G1期；CSE能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，且由Fas受體所介導(dǎo)的死亡受體途徑參與此凋亡過程；CSE所引起的氧化應(yīng)激可能是其抑制肺泡上皮細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的始動(dòng)因素；TGF-β1，p21WAF1，和IGFBP-2可能參與介導(dǎo)了CSE所致

10、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的生長抑制作用；CSE可能通過不依賴于p53的通路來上調(diào)p21WAF1的表達(dá)；ATRA可能通過對(duì)TGF-β信號(hào)通路的干涉而下調(diào)p21WAF1的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促增殖作用；ATRA和NAC對(duì)IGFBP-2的下調(diào)可能是其調(diào)節(jié)受CSE抑制的肺泡上皮細(xì)胞增殖的另一種機(jī)制。 第一部分香煙煙霧提取物對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖周期的抑制作用及其與p21WAF1的關(guān)系 目的探討香煙煙霧提取物(cigarettesmokeex

11、tract,CSE)對(duì)人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的A549細(xì)胞增殖周期的影響及其與p21WAF1的關(guān)系。方法通過相差顯微鏡觀察CSE對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響；MTT法測(cè)定細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)變化；運(yùn)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)技術(shù)和免疫印跡法檢測(cè)不同濃度CSE作用48小時(shí)后p21WAF1在mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化。結(jié)論CSE使

12、肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的生長被阻滯在其細(xì)胞周期的G1期，p21WAF1在細(xì)胞內(nèi)的高表達(dá)可能是其導(dǎo)致肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞增殖抑制的機(jī)制之一。 第二部分香煙煙霧提取物誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮來源的A549細(xì)胞通過Fas/APO-1參與的死亡受體途徑而凋亡 目的研究香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)對(duì)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的A549細(xì)胞的損傷作用并探討與其相關(guān)的分子機(jī)制。方法運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)CSE對(duì)細(xì)胞活力的影

13、響；通過Hoechst33258染色以及透射電鏡的手段觀察形態(tài)學(xué)變化；以流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行Fas受體表達(dá)和Caspase-3活性的測(cè)定；運(yùn)用DNA瓊脂糖凝膠電泳和AnnexinV-FITC/和碘化丙錠雙染法從生化水平進(jìn)行檢測(cè)；以H2DCFDA染色來判斷細(xì)胞內(nèi)氧自由基的含量。結(jié)論本研究表明CSE能夠抑制肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞來源的A549細(xì)胞的生長和增殖，并誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，由Fas受體所介導(dǎo)的死亡受體途徑參與此凋亡過程。而CSE所引起的氧化應(yīng)激則可

14、能是阻止肺泡上皮細(xì)胞生長增殖并誘導(dǎo)其凋亡的始動(dòng)因素。 第三部分維生素A酸對(duì)香煙煙霧提取物所致肺泡上皮細(xì)胞生長抑制的保護(hù)作用及其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 目的研究全反式維甲酸(all-transretinoicacid，ATRA)對(duì)暴露于香煙煙霧提取物(cigarettesmokeextract，CSE)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞增殖的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。方法本實(shí)驗(yàn)選用來源于人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的A549細(xì)胞株作為研究對(duì)象。

15、以MTT比色法檢測(cè)CSE和ATRA對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響；運(yùn)用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR的方法對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactor-betal，TGF-β1)，p53，細(xì)胞周期素依賴性的激酶抑制劑(cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)p21WAF1，以及cyclinE和CDK2(cyclin-dependentkinase2，CDK2)在轉(zhuǎn)錄水平的變化

16、進(jìn)行了觀察；對(duì)這些因子在蛋白水平的表達(dá)采用免疫印跡法，免疫組織化學(xué)法以及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)論本研究證實(shí)RA能夠拮抗受CSE誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞的生長抑制作用；CSE可能通過不依賴于p53的通路來上調(diào)p21WAF1的表達(dá)；RA可能通過對(duì)TGF-β信號(hào)通路的干涉而下調(diào)p21WAF1的表達(dá)，再進(jìn)一步發(fā)揮其促增殖作用。 第四部分維生素A酸和N-乙酰基-L-半胱氨酸對(duì)受香煙煙霧提取物抑制的肺泡上皮細(xì)胞中IGFBP-2表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

17、 目的研究全反式維生素A酸和N-乙酰-L-半胱氨酸對(duì)受香煙煙霧提取物刺激的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)作用及其與IGFBP-2的關(guān)系。方法運(yùn)用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活力；以熒光探針H2DCFDA負(fù)載以后利用流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)性氧自由基水平(reactiveoxygenspecies，ROS)；以實(shí)時(shí)定量PCR，半定量PCR以及Westernblot的方法檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞在受到香煙煙霧提取物，全反式維生素A酸和N-乙酰-L-半