大豆SMV誘導(dǎo)的EST表達(dá)譜分析及SR-EF基因研究.pdf

1、黑龍江省是我國(guó)大豆的主要產(chǎn)區(qū)，影響黑龍江省大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害之一就是大豆花葉病毒病。通過(guò)分子手段尋找抗大豆花葉病毒病基因及研究抗病分子機(jī)制是一種快捷而有效的抗病育種途徑。本實(shí)驗(yàn)旨在利用SSH技術(shù)和RACE技術(shù)，對(duì)抗大豆花葉病毒病的大豆品種8143在抗病過(guò)程中表達(dá)譜進(jìn)行分析，闡明其抗病的分子機(jī)制。并進(jìn)一步尋找該品種的抗病相關(guān)基因，為功能性大豆抗病基因的克隆和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆抗病性奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：1.以抗大豆花葉病毒

2、病品種東農(nóng)8143為實(shí)驗(yàn)材料，接種大豆花葉病毒1號(hào)株系后，對(duì)接種樣品和未接種樣品分別動(dòng)態(tài)取樣，利用SSH技術(shù)進(jìn)行消減，構(gòu)建消減文庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)化計(jì)算得到質(zhì)粒文庫(kù)滴度，1/8的連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化得到了240個(gè)陽(yáng)性克隆，因此本消減文庫(kù)的滴度約為2000個(gè)。2.挑取陽(yáng)性克隆隨機(jī)送交測(cè)序，共對(duì)64個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行了測(cè)序。去除測(cè)序效果不好的EST序列，共獲得質(zhì)量較好的EST序列50條。測(cè)序結(jié)果顯示ESTs片段中最短的為136bp，最長(zhǎng)的691bp，平均長(zhǎng)度為4

3、56bp，有41條序列帶有poly(A)尾。將所獲得的50條新EST序列提交GenBank的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)如下：dbEST-ID為26613115-26613156；26613925-26613932，對(duì)應(yīng)的GenBankAccn為CV997220-CV997261；CV998030-CV998037。將測(cè)序結(jié)果到GenBank進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì)，其中38個(gè)有比較明確的比對(duì)結(jié)果。測(cè)序表明抗病相關(guān)的EST表達(dá)

4、譜包括的同源基因涉及19種生物，基因功能涉及大豆的細(xì)胞自身保護(hù)、信號(hào)傳導(dǎo)、抑制病原菌生長(zhǎng)、系統(tǒng)獲得性抗性、以及與光合作用、呼吸作用、蛋白質(zhì)合成等相關(guān)的持家基因。功能基因不明確或新基因有12個(gè)。3.從消減文庫(kù)中獲取差異表達(dá)片段CY88，其登錄號(hào)為：dbEST-ID：26613929GenBank-Accn：CV998034。采用5′RACE技術(shù)，獲得全長(zhǎng)cDNA基因SR-EF-1。其長(zhǎng)度為971bp。在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)為AY6

5、51886。對(duì)SR-EF-1基因進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果表明，SR-EF-1基因沒(méi)有接種時(shí)有輕微的表達(dá)，隨著接種時(shí)數(shù)的增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，72h到達(dá)峰值。隨后表達(dá)呈下降趨勢(shì)，而在204h又出現(xiàn)一個(gè)小峰。因此，SR-EF-1基因是一種誘導(dǎo)表達(dá)型基因。Southern雜交結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在每一組酶切中至少有2～3條條帶，表明SR-EF-1基因確為大豆基因組片段，也同時(shí)表明該基因在大豆基因組中以2個(gè)拷貝或低拷貝形式存在。4.根據(jù)全長(zhǎng)cDNA基因設(shè)

6、計(jì)引物，擴(kuò)增基因組DNA，獲得全長(zhǎng)DNA基因G-SR-EF-1，比較可知，SR-EF-1和G-SR-EF-1基因等長(zhǎng)，無(wú)內(nèi)含子序列。5.利用LM-PCR技術(shù)在SR-EF-1的基礎(chǔ)上獲得SR-EF-2基因，其長(zhǎng)度為1559bp。通過(guò)NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的ProteinConservationDomain程序?qū)R-EF-2基因編碼的294個(gè)氨基酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，大豆SR-EF-2基因