17795.嗜熱菌中ng802中l(wèi)ada的體外定向進(jìn)化及facl的功能鑒定

1、南開大學(xué)博士學(xué)位論文嗜熱菌中NG802中LadA的體外定向進(jìn)化及Facl的功能鑒定姓名：董焱鵬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：馮露201205摘要型LadA相比，突變酶活性(‰。t)提高234倍，其中F146N／N376I具有最高活性；催化效率(‰卅‰)提高了19127倍，其中F146E／N376I和A102E提高最多。對(duì)突變酶的最適反應(yīng)溫度，最適反應(yīng)pH，熱穩(wěn)定性及底物范圍等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。表達(dá)LadA突變體的Pseud

2、omonasfluoresce，zsKOB2A1菌株比表達(dá)LMA野生型酶的KOB2A1菌株在以十六烷為唯一碳源和能量來(lái)源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快，從而在體內(nèi)驗(yàn)證了LadA突變體的活性。對(duì)通過(guò)易錯(cuò)PCR技術(shù)得到的3個(gè)突變酶進(jìn)行氨基酸置換。運(yùn)用計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行同源模建，進(jìn)一步研究了酶活性提高與結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系。本研究得到的突變體在石油污染治理和原油開發(fā)等生物過(guò)程中具有很大的應(yīng)用潛力。二長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶Fatl的功能鑒定本研究對(duì)NG802長(zhǎng)鏈烷

3、烴降解途徑中第四步的兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪酸輔酶A連接酶(Facll和Facl2)基因GTNG0892和GTNG1447進(jìn)行了克隆表達(dá)和體外功能鑒定。Facll在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物分別為同二聚體，F(xiàn)acl2在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物為非球狀單體或同二聚體。Facll和Facl2均可以催化c2到C30的脂肪酸，F(xiàn)acll的最適底物是癸酸，F(xiàn)acl2的最適底物是棕櫚酸。Facll和Facl2最適反應(yīng)溫度為均為60℃，最適反應(yīng)pH均為75，且需要ATP作

4、為輔因子。對(duì)Facll和Facl2的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。同時(shí)分析了金屬離子，EDTA，SDS和TritonX100對(duì)酶活的影響。實(shí)時(shí)定量PCR顯示，當(dāng)NG802在以原油為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，fadl和facl2的mRNA水平發(fā)生了上調(diào)。本研究對(duì)NG802中其余5個(gè)Facl酶也進(jìn)行了克隆表達(dá)和功能鑒定。發(fā)現(xiàn)這5個(gè)Facl酶不能降解鏈長(zhǎng)超過(guò)C14的脂肪酸，因此，可以確定Facll和Facl2催化長(zhǎng)鏈烷烴降解途徑中第四步反應(yīng)。這是在細(xì)菌