DON誘導(dǎo)望水白cDNA文庫(kù)構(gòu)建與基因表達(dá)分析.pdf

1、由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是世界溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生的一種嚴(yán)重性病害。該病發(fā)生后，不僅造成產(chǎn)量損失，而且病麥粒中含有多種危害人、畜健康的單端孢霉烯族毒素，其中脫氧血腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，簡(jiǎn)稱DON)危害最大，但是有關(guān)小麥抗DON遺傳機(jī)制方面的研究報(bào)道較少。本研究以我國(guó)高抗赤霉病小麥品種望水白為試材，構(gòu)建了DON誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)，并通過(guò)EST測(cè)序、半定量RT-PCR和染色體定位分析，旨在揭示DON誘導(dǎo)后小麥

2、基因的表達(dá)特點(diǎn)，為小麥抗DON遺傳育種研究提供新的信息。研究結(jié)果如下： 選取抽穗后2d的望水白穗子，通過(guò)單花滴注接種DON(100mg·kg-1)，分別提取誘導(dǎo)24 h和48 h的RNA等量混合后，使用SMART文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建了DON誘導(dǎo)穗組織λ噬菌體cDNA文庫(kù)，滴度測(cè)定表明，初始文庫(kù)滴度為3x106 pfu/mL，重組率達(dá)95％，能夠代表mRNA的復(fù)雜度，擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度為2×109 pfu/mL；初始文庫(kù)直接轉(zhuǎn)入大腸桿

3、菌BM25.8，經(jīng)檢測(cè)，其插入片段介于500～2000 bp，平均1053 bp。 隨機(jī)挑選96個(gè)克隆進(jìn)行3'端測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度介于60-891bp，平均393 bp。選取48條長(zhǎng)度大于300 bp的EST在NCBI的GenBank中用BLAST軟件進(jìn)行比對(duì)后將其分成6類：(1)核糖體蛋白基因6條(13％)；(2)初級(jí)代謝與次生代謝相關(guān)基因8條(18％)；(3)DNA結(jié)合、RNA加工相關(guān)蛋白基因4條(9％)；(4)免疫或逆境相關(guān)蛋

4、白基因5條(11％)；(5)未知功能基因9條(20％)；(6)未發(fā)現(xiàn)顯著同源性的基因13條(29％)。 根據(jù)這些序列，共設(shè)計(jì)17對(duì)新的小麥EST-PCR引物，并成功用于半定量RT-PCR擴(kuò)增。以DON誘導(dǎo)0、6、12、24、48、72、96、120 h的望水白穗組織cDNA為模板，半定量分析發(fā)現(xiàn)，14個(gè)EST基因表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，1個(gè)基因表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，2個(gè)基因表達(dá)無(wú)差異。 利用一套中國(guó)春缺體-四體進(jìn)行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，cl