廣西巴馬小型豬Myostatin和Leptin基因的克隆、表達(dá)及動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn).pdf

1、肌肉生長抑制素(Myostatin)屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族成員之一，又名為生長／分化因子-8(GDF-8)。Myostatin是在骨骼肌中廣泛表達(dá)的一類糖蛋白，其作用特征是對(duì)肌肉生長有負(fù)調(diào)控作用，myostatin基因自然突變導(dǎo)致其生物活性的改變可以引起肌肉重量的顯著增加。 瘦素蛋白(Leptin)是由脂肪組織合成的一種重要肽類激素。通過與細(xì)胞膜上的長型受體結(jié)合，leptin啟動(dòng)了胞內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，將身

2、體能量貯存水平信號(hào)傳送至大腦，從而對(duì)能量攝入與消耗進(jìn)行調(diào)節(jié)。 參照GenBank發(fā)表的豬myostatin和leptin基因序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，以廣西巴馬小型豬肌肉組織和脂肪組織的總RNA為模板，通過反向聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出相應(yīng)的cDNA片段。擴(kuò)增片段純化后，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)菌擴(kuò)增并測(cè)序。結(jié)果表明：擴(kuò)增的myostatin基因序列為1128bp，leptin成熟肽基因序列為441

3、bp，包含了各自成熟肽序列。同源性比較顯示，廣西巴馬小型豬myostatin和leptin基因與GenBank報(bào)道的豬的相應(yīng)基因序列的同源性分別達(dá)到99.7％和99.1％。 將克隆得到的myostatin和leptin基因序列，分別加入BamHI和EcoRI、BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，定向連接到原核表達(dá)載體pRSETA質(zhì)粒上，構(gòu)建pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE

4、3)LysS。經(jīng)SDS-PAGE和western Blotting分析，本研究成功地表達(dá)了myostatin和leptin的融合蛋白。表達(dá)蛋白經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)7h(myostatin)或4h(leptin)表達(dá)量達(dá)到最高，并以包涵體的形式存在。將pRSETA-MSNT75和pRSETA-leptin重組菌進(jìn)行大量表達(dá)后，包涵體用6mol/L的鹽酸胍變性，可溶部分在50％Ni-NTA樹脂上過柱純化，通過透析使蛋白質(zhì)復(fù)性，得

5、到較純的MSNT75和leptin融合蛋白。利用純化得到的融合蛋白制備了MSNT75和leptin融合蛋白油乳劑疫苗。 本研究應(yīng)用廣西巴馬小型豬myostatin成熟肽重組融合蛋白疫苗主動(dòng)免疫小鼠、廣西巴馬小型豬和雞后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，其平均體重和平均增重都有下降的趨勢(shì)，但差異不顯著(P>0.05)，體內(nèi)并未檢測(cè)到相應(yīng)的抗體。用廣西巴馬小型豬leptin成熟肽重組融合蛋白疫苗主動(dòng)免疫小鼠后，小鼠的體重沒有顯著變化(P>0.0