廣西巴馬小型豬PERV全基因擴(kuò)增與分析及cDNA克隆的構(gòu)建.pdf

1、使用豬源器官進(jìn)行異種移植被認(rèn)為是解決當(dāng)前人源供體器官短缺,治療終末期器官疾病的有效方法之一。而廣西巴馬小型豬是采用閉鎖純繁近交方式選育的廣西地方特有的小型豬品種,是一種遺傳穩(wěn)定,性狀優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,可作為異種移植的理想器官供體。但是,由于廣西巴馬小型豬體內(nèi)普遍存在豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV),能夠以前病毒DNA形式整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中,并隨細(xì)胞染色體復(fù)制而復(fù)制。PERV在體

2、外可以感染多種人源細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),引起了人們對(duì)異種移植安全性的廣泛關(guān)注。因此,有必要開(kāi)展廣西巴馬小型豬PERV的基礎(chǔ)研究,了解其感染機(jī)制,以評(píng)估PERV的病原安全性。
　　本研究采用PCR技術(shù),擴(kuò)增獲得4條覆蓋廣西巴馬小型豬PERV全基因的重疊片段,經(jīng)拼接獲得1條完整的廣西巴馬小型豬PERV(PERV-BM)全基因序列,大小為8774 bp。遺傳進(jìn)化分析表明PERV-BM屬于PERV A亞型;序列分析發(fā)現(xiàn),PERV-BM的5′UTR的

3、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域分別位于400-467 bp與313-432 bp位置;對(duì)推導(dǎo)氨基酸序列分析則發(fā)現(xiàn)病毒的env蛋白中含有15個(gè)可能的抗原表位,其跨膜區(qū)位于600-622 aa位置,含有Ser、Thr和Tyr磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量分別為20、7和9個(gè),并含有10個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。利用分子鐘假說(shuō)對(duì)PERV-BM的3′LTR及本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的另外8條PERV-BM的3′LTRs進(jìn)行分析,結(jié)果表明PERV-BM大約進(jìn)化于7.1×106年前。
　

4、　在完成全基因測(cè)序的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步構(gòu)建了PERV-BM全基因cDNA克隆。將4個(gè)覆蓋全基因組的重疊基因片段通過(guò)pMD18-T中間載體依次連接并克隆到pBluescript II SK(-)載體上,構(gòu)建cDNA克隆。將該cDNA克隆與GenBank登錄所有PERV全序列進(jìn)行比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)存在15個(gè)保守堿基的突變。為消除這些突變位點(diǎn)在下一步病毒拯救中造成的潛在影響,通過(guò)定點(diǎn)突變和化學(xué)合成的方法成功恢復(fù)15個(gè)突變堿基。將突變后的PERV

5、-BM全長(zhǎng)序列上傳GenBank,登錄號(hào)為HM159246。同時(shí)為便于鑒定,本研究還在所構(gòu)建cDNA克隆上引入突變,將BM-PERV全長(zhǎng)cDNA克隆第8408位堿基由A突變?yōu)镃,引入新的單一酶切位點(diǎn)Aat II,獲得了cDNA克隆的突變株。經(jīng)Not I/Nhe I、Nhe I/Cal I、Not I/Cal I酶切及全長(zhǎng)測(cè)序鑒定,證實(shí)所構(gòu)建的cDNA克隆為PERV-BM全基因的cDNA克隆,命名為pBluescript II SK-PE