19552.重組bmdnvdna對(duì)細(xì)胞的感染性及家蠶微孢子蟲轉(zhuǎn)基因探索

1、碩士學(xué)位論文論文題目重組BmDNVDNA對(duì)細(xì)胞的感染性及家蠶微孢子蟲轉(zhuǎn)基因探索研究生姓名郭睿指導(dǎo)教師姓名朱越雄（副教授）、貢成良（教授）專業(yè)名稱微生物學(xué)研究方向生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文提交日期2012年4月重組重組BmDNVDNA對(duì)細(xì)胞的感染性及家蠶微孢子的轉(zhuǎn)基因探索對(duì)細(xì)胞的感染性及家蠶微孢子的轉(zhuǎn)基因探索中文摘要中文摘要I中文摘要家蠶濃核病毒（Bombyxmidensovirus，BmDNV）基因組有兩種不同的單鏈DNA（VD1和VD2

2、），分別存在于不同的病毒粒子中。目前，BmDNV中國(guó)（鎮(zhèn)江）株（BmDNVZhenjiangstrain，BmDNVZ）兩種DNA的核苷酸序列已經(jīng)測(cè)定，其中VD1上含有4個(gè)Fs，可以編碼病毒粒子的全部結(jié)構(gòu)蛋白，而VD2上只有3個(gè)Fs，不含有編碼全部結(jié)構(gòu)蛋白的遺傳信息，推測(cè)兩種病毒粒子在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程中可能具有互為輔助病毒的作用。家蠶濃核病毒只特異性地浸染中腸上皮組織中的圓筒型細(xì)胞，目前還沒有一種細(xì)胞系可供BmDNV感染，因此研究重組

3、BmDNVDNA對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染性，對(duì)探討B(tài)mDNV的復(fù)制及病毒基因的功能有重要幫助。本研究將帶有VD1和VD2的重組質(zhì)粒pGEMVD1和pMDVD2分別和共同轉(zhuǎn)染家蠶BmN培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的病理變化，通過(guò)免疫熒光法可在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中檢測(cè)到BmDNV的結(jié)構(gòu)蛋白，表明pGEMVD1、pMDVD2能在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制、并表現(xiàn)出對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的感染性；進(jìn)一步通過(guò)BactoBac載體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建了具有BmDNVZVD1基因組的重組病毒

4、BmBacVD1，BmBacVD1感染家蠶BmN細(xì)胞，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的病理變化，免疫學(xué)熒光檢測(cè)結(jié)果顯示BmBacVD1能在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)BmDNV的結(jié)構(gòu)蛋白，通過(guò)電鏡能在感染細(xì)胞中觀察到桿狀和球狀二種類型的病毒樣粒子，密度梯度分離球狀病毒樣粒子，分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果初步顯示，球狀病毒樣顆粒中包裹有BmBacVD1DNA，表明BmDNVDNA裝載進(jìn)桿狀病毒基因組后，能隨著桿狀病毒的復(fù)制、增殖，形成BmDNV的病毒蛋白，并能形成包裹重組DNA的

5、BmDNV樣的病毒顆粒。家蠶微孢子蟲（Nosemabombycis）是家蠶的重要病原，因具有胚種傳染特性，對(duì)蠶種生產(chǎn)威協(xié)嚴(yán)重。目前，家蠶微孢子蟲的基因組序列測(cè)定已完成，但缺乏微孢子蟲的基因功能研究平臺(tái)。本研究用純化的家蠶微孢子感染家蠶，爾后用脂質(zhì)體介導(dǎo)分別將piggyBac轉(zhuǎn)座子載體pigA3GFP和昆蟲非轉(zhuǎn)座子表達(dá)載體pIZTV5His轉(zhuǎn)染家蠶，取蠶血與BmN細(xì)胞混合培養(yǎng)，顯微觀察結(jié)果顯示，培養(yǎng)BmN細(xì)胞呈現(xiàn)微孢子蟲感染樣病理變化，部