家蠶微孢子蟲在昆蟲細胞中的增殖及CQ1株系建立的研究.pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是一類細胞內(nèi)專性寄生的單細胞真核生物，在自然界已發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲有150個屬，約1400個種，是經(jīng)濟昆蟲、魚類、皮毛動物、靈長類的常見病原。目前發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲中至少5個屬13個種能感染家蠶，8個屬14個種與人類疾病有關。微孢子蟲隸屬原生動物界(Protisia)、微孢子蟲門(Microspora)、微孢子蟲綱(Microsporea)、微孢子蟲目(Microsporida)。但近期研究將微孢子蟲歸屬于

2、真菌界，并與鞭毛真菌亞門的內(nèi)寄生壺菌(Rozella allomycis)的進化關系比較緊密。由于微孢子蟲與人類的免疫抑制疾病有關以及它的倍受科學界爭議的進化地位，日益引起學者們的關注。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)主要寄生于家蠶，由其引發(fā)的微粒子病，是家蠶的毀滅性病害。由于其能經(jīng)卵傳播而被列為蠶絲生產(chǎn)國的唯一檢疫對象。大部分微孢子蟲有一定的寄主專一性，但也有寄主域較廣的微孢子蟲。家蠶微孢子蟲除寄生于家蠶外，還可以寄生于

3、其他40余種昆蟲。微孢子蟲的變異不僅表現(xiàn)在形態(tài)上的變化，而且在分子水平上也有差異，據(jù)最近的基因組學研究發(fā)現(xiàn)，即使同一個區(qū)域內(nèi)的家蠶微孢子，也表現(xiàn)出基因組的異質(zhì)性，具有豐富的多樣性的特點。家蠶微孢子蟲CQ1原始分離株保藏于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，是上世紀80年代由西南農(nóng)業(yè)大學蠶病研究室從重慶北碚地區(qū)病蠶體內(nèi)分離。 本研究在建立了家蠶微孢子蟲侵染草地貪夜蛾卵巢細胞(Sf21)和家蠶卵巢細胞(BmN-SWU)體系的基礎上，采取

4、感染家蠶微孢子蟲的絲腺單病斑分離出微孢子蟲接種細胞，并在細胞中進行傳代培養(yǎng)，在Sf21細胞中傳代培養(yǎng)到第八代，用此方法純化家蠶微孢子蟲，以期得到遺傳背景清楚的家蠶微孢子蟲CQ1株系；并通過對家蠶微孢子蟲CQ1株系rDNA-ITS進行分析，并結合GenBank中Nosema屬微孢子蟲的同源序列，構建rDNA-ITS系統(tǒng)樹，對家蠶微孢子蟲CQ1株系的純粹性進行了分子評價。 1、家蠶微孢子蟲侵染草地貪夜蛾卵巢細胞和家蠶卵巢細胞體系的建

5、立 草地貪夜蛾卵巢細胞(Sf21)具有生長速度快、易培養(yǎng)等優(yōu)點，我們在諸多的研究基礎上，利用草地貪夜蛾卵巢細胞(Sf21)建立家蠶微孢子體外感染增殖體系，同時對孢子在細胞系中的增殖進行了觀察。同時利用家蠶卵巢細胞(BmN)建立家蠶微孢子體外感染增殖體系。故本研究選擇利用了Sf21細胞系和BmN細胞系建立了家蠶微孢子蟲的感染增殖體系，為家蠶微孢子蟲功能基<組研究提供了一個補充體系，也為獲得未污染的實驗材料(N.b)提供了新的途徑。

6、 從觀察到的現(xiàn)象可見，家蠶微孢子蟲在寄主細胞中的發(fā)育是一個漸進過程，最終將占據(jù)寄主細胞質(zhì)的空間，感染細胞的家蠶微孢子蟲先于細胞內(nèi)周質(zhì)周緣繁殖，后向中間擴展，最后孢子布滿整個細胞質(zhì)空間。隨著時間的增加，寄主細胞終破裂，釋放孢子。此外，在孢子繁殖后期，大量孢子從細胞內(nèi)逸出后，有合胞體(巨型多核融合細胞)出現(xiàn)。 2、家蠶絲腺單病斑微孢子蟲接種昆蟲細胞及其傳代培養(yǎng) 采用家蠶絲腺單病斑的微孢子蟲接種草地貪夜蛾卵巢細胞和家蠶

7、卵巢細胞，對單病斑的微孢子蟲在細胞中的感染增殖進行定期觀察，并把增殖的家蠶微孢子蟲在細胞中進行傳代培養(yǎng)，在草地貪夜蛾卵巢細胞中傳代培養(yǎng)八代，在家蠶卵巢細胞中傳代培養(yǎng)六代，以期得到純粹性好的的家蠶微孢子蟲株系，并對細胞傳代培養(yǎng)后的家蠶微孢子蟲的形態(tài)與家蠶微孢子蟲CQ1分離株進行比較。 3、家蠶微孢子蟲CQ1株純粹性的分子評價 對所獲得家蠶微孢子蟲株的純粹性進行分子評價。通過克隆所獲得家蠶微孢子蟲株的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(r

8、DNA-ITS)，并分析其序列多態(tài)性，從而對家蠶微孢子蟲CQ1株的純粹性進行分子評價。 利用特異引物進行聚合酶鏈式反應以擴增家蠶微孢子蟲CQ1株rDNA-ITS區(qū)，經(jīng)PCR反應擴增出長503～516 bp的家蠶微孢子蟲rDNA-ITS基因序列。完成了rDNA-ITS12個克隆測序，rDNA-ITS1與GenBank中序列號為AY259631的家蠶微孢子蟲序列相似性為98％；另外其它克隆序列與GenBank中的家蠶微孢子蟲序列相似

9、性為88％～96％之間。序列比對發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲rDNA-ITS基因存在著單核苷酸的轉(zhuǎn)換和顛換，以及插入和缺失，并且差異位點大多位于ITS區(qū)域內(nèi)。 研究結果表明，從ITS序列分析來看，所建立的家蠶微孢子蟲CQ1株系的種內(nèi)遺傳分化比較明顯，各克隆存在序列多態(tài)性，究其原因，可能由于我們的純化工作還不夠，也可能ITS序列不適合作為評價家蠶微孢子蟲純粹性的分子標記。因為我們發(fā)現(xiàn)在基因組內(nèi)rDNA單元是多拷貝的，小亞基、大亞基和5S rD