家蠶微孢子蟲在昆蟲細(xì)胞中的增殖及CQ1株系建立的研究.pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物，在自然界已發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲有150個屬，約1400個種，是經(jīng)濟昆蟲、魚類、皮毛動物、靈長類的常見病原。目前發(fā)現(xiàn)的微孢子蟲中至少5個屬13個種能感染家蠶，8個屬14個種與人類疾病有關(guān)。微孢子蟲隸屬原生動物界(Protisia)、微孢子蟲門(Microspora)、微孢子蟲綱(Microsporea)、微孢子蟲目(Microsporida)。但近期研究將微孢子蟲歸屬于

2、真菌界，并與鞭毛真菌亞門的內(nèi)寄生壺菌(Rozella allomycis)的進化關(guān)系比較緊密。由于微孢子蟲與人類的免疫抑制疾病有關(guān)以及它的倍受科學(xué)界爭議的進化地位，日益引起學(xué)者們的關(guān)注。家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis)主要寄生于家蠶，由其引發(fā)的微粒子病，是家蠶的毀滅性病害。由于其能經(jīng)卵傳播而被列為蠶絲生產(chǎn)國的唯一檢疫對象。大部分微孢子蟲有一定的寄主專一性，但也有寄主域較廣的微孢子蟲。家蠶微孢子蟲除寄生于家蠶外，還可以寄生于

3、其他40余種昆蟲。微孢子蟲的變異不僅表現(xiàn)在形態(tài)上的變化，而且在分子水平上也有差異，據(jù)最近的基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，即使同一個區(qū)域內(nèi)的家蠶微孢子，也表現(xiàn)出基因組的異質(zhì)性，具有豐富的多樣性的特點。家蠶微孢子蟲CQ1原始分離株保藏于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，是上世紀(jì)80年代由西南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶病研究室從重慶北碚地區(qū)病蠶體內(nèi)分離。 本研究在建立了家蠶微孢子蟲侵染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf21)和家蠶卵巢細(xì)胞(BmN-SWU)體系的基礎(chǔ)上，采取

4、感染家蠶微孢子蟲的絲腺單病斑分離出微孢子蟲接種細(xì)胞，并在細(xì)胞中進行傳代培養(yǎng)，在Sf21細(xì)胞中傳代培養(yǎng)到第八代，用此方法純化家蠶微孢子蟲，以期得到遺傳背景清楚的家蠶微孢子蟲CQ1株系；并通過對家蠶微孢子蟲CQ1株系rDNA-ITS進行分析，并結(jié)合GenBank中Nosema屬微孢子蟲的同源序列，構(gòu)建rDNA-ITS系統(tǒng)樹，對家蠶微孢子蟲CQ1株系的純粹性進行了分子評價。 1、家蠶微孢子蟲侵染草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞和家蠶卵巢細(xì)胞體系的建

5、立 草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf21)具有生長速度快、易培養(yǎng)等優(yōu)點，我們在諸多的研究基礎(chǔ)上，利用草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞(Sf21)建立家蠶微孢子體外感染增殖體系，同時對孢子在細(xì)胞系中的增殖進行了觀察。同時利用家蠶卵巢細(xì)胞(BmN)建立家蠶微孢子體外感染增殖體系。故本研究選擇利用了Sf21細(xì)胞系和BmN細(xì)胞系建立了家蠶微孢子蟲的感染增殖體系，為家蠶微孢子蟲功能基<組研究提供了一個補充體系，也為獲得未污染的實驗材料(N.b)提供了新的途徑。

6、 從觀察到的現(xiàn)象可見，家蠶微孢子蟲在寄主細(xì)胞中的發(fā)育是一個漸進過程，最終將占據(jù)寄主細(xì)胞質(zhì)的空間，感染細(xì)胞的家蠶微孢子蟲先于細(xì)胞內(nèi)周質(zhì)周緣繁殖，后向中間擴展，最后孢子布滿整個細(xì)胞質(zhì)空間。隨著時間的增加，寄主細(xì)胞終破裂，釋放孢子。此外，在孢子繁殖后期，大量孢子從細(xì)胞內(nèi)逸出后，有合胞體(巨型多核融合細(xì)胞)出現(xiàn)。 2、家蠶絲腺單病斑微孢子蟲接種昆蟲細(xì)胞及其傳代培養(yǎng) 采用家蠶絲腺單病斑的微孢子蟲接種草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞和家蠶

7、卵巢細(xì)胞，對單病斑的微孢子蟲在細(xì)胞中的感染增殖進行定期觀察，并把增殖的家蠶微孢子蟲在細(xì)胞中進行傳代培養(yǎng)，在草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞中傳代培養(yǎng)八代，在家蠶卵巢細(xì)胞中傳代培養(yǎng)六代，以期得到純粹性好的的家蠶微孢子蟲株系，并對細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的家蠶微孢子蟲的形態(tài)與家蠶微孢子蟲CQ1分離株進行比較。 3、家蠶微孢子蟲CQ1株純粹性的分子評價 對所獲得家蠶微孢子蟲株的純粹性進行分子評價。通過克隆所獲得家蠶微孢子蟲株的rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(r

8、DNA-ITS)，并分析其序列多態(tài)性，從而對家蠶微孢子蟲CQ1株的純粹性進行分子評價。 利用特異引物進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以擴增家蠶微孢子蟲CQ1株rDNA-ITS區(qū)，經(jīng)PCR反應(yīng)擴增出長503～516 bp的家蠶微孢子蟲rDNA-ITS基因序列。完成了rDNA-ITS12個克隆測序，rDNA-ITS1與GenBank中序列號為AY259631的家蠶微孢子蟲序列相似性為98％；另外其它克隆序列與GenBank中的家蠶微孢子蟲序列相似

9、性為88％～96％之間。序列比對發(fā)現(xiàn)家蠶微孢子蟲rDNA-ITS基因存在著單核苷酸的轉(zhuǎn)換和顛換，以及插入和缺失，并且差異位點大多位于ITS區(qū)域內(nèi)。 研究結(jié)果表明，從ITS序列分析來看，所建立的家蠶微孢子蟲CQ1株系的種內(nèi)遺傳分化比較明顯，各克隆存在序列多態(tài)性，究其原因，可能由于我們的純化工作還不夠，也可能ITS序列不適合作為評價家蠶微孢子蟲純粹性的分子標(biāo)記。因為我們發(fā)現(xiàn)在基因組內(nèi)rDNA單元是多拷貝的，小亞基、大亞基和5S rD