致雄性不育基因—反義肌動蛋白基因和核糖核酸酶基因（Barnase）導入甘藍的研究.pdf

1、該研究將致雄性不育的基因----反義肌動蛋白基因和Barnase基因分別與不同組織表達特異啟動子構(gòu)成嵌合基因后分別通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化甘藍,以期獲得雄性不育轉(zhuǎn)基因甘藍植株.主要的工作和結(jié)果如下:1.甘藍高頻再生體系的建立以甘藍的下胚軸為外植體,以MS為基本培養(yǎng)基(添加0.7％的瓊脂和3％的蔗糖),加入不同濃度和組合的激素6-BA、NAA,篩選出下胚軸不定芽分化最佳培養(yǎng)基(MS+BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L);并比較了甘藍下胚軸

2、和子葉兩種不同外植體的分化能力,下胚軸的分化頻率高于子葉.同時進行了甘藍不定芽的生根實驗.2.甘藍外植體分化、不定芽生長以及不定芽生根對除草劑(PPT)的敏感性分析在分化培養(yǎng)基中加入濃度為2.0mg/L的PPT時,外植體愈傷組織形成明顯受到抑制,形成的愈傷組織也部分死亡;當加入的PPT濃度為2.5mg/L時,外植體及部分形成的愈傷組織全部逐漸白化死亡;當PPT濃度為3.0mg/L時,外植體未形成愈傷組織就白化死亡,因此確定PPT 2.5

3、mg/L的濃度作為外植體轉(zhuǎn)化的篩選壓.3.甘藍外植體高頻轉(zhuǎn)化體系的建立在最佳培養(yǎng)基上試驗了外植體的預培養(yǎng)時間、浸菌時間、共培養(yǎng)時間、選用何種抗生素抑菌以及乙酰丁香酮(AS)等因素對轉(zhuǎn)化率的影響,建立了甘藍外植體的高頻轉(zhuǎn)化體系:以6-7天的甘藍下胚軸為外植體,分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)2天,在用MS液體培養(yǎng)基稀釋的菌液中感菌3-5分鐘,共培養(yǎng)2天后,轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基1(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+PPT2.5mg/L+Ca

4、rb500mg/L)中篩選抗性愈傷組織和抗性芽,每兩周換一次培養(yǎng)基.4.轉(zhuǎn)基因植株的鑒定提取轉(zhuǎn)基因植株的總DNA,分別對其轉(zhuǎn)化的目的基因(反義肌動蛋白基因,Barnase基因),目的基因的啟動子(TA29,NTM19)以及篩選基因(Bar基因)進行PCR擴增,轉(zhuǎn)化植株均擴增出相應目的大小片段,而非轉(zhuǎn)化植株都呈陰性.結(jié)果證明致雄性不育的反義肌動蛋白基因和Barnase基因已被整合到甘藍的基因組中.將經(jīng)過PCR檢測確認的甘藍植株的葉片接種入