轉(zhuǎn)crylAc基因抗蟲(chóng)棉鄂雜棉1號(hào)外源插入序列分析及特異性PCR檢測(cè)方法.pdf

1、轉(zhuǎn)基因作物的分子結(jié)構(gòu)特征既是對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ),也是建立定性和定量檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。本研究以轉(zhuǎn)cry1Ac基因抗蟲(chóng)棉“鄂雜棉1號(hào)”為實(shí)驗(yàn)材料,探索了其外源DNA插入結(jié)構(gòu)的分析方法,并對(duì)其基因組一端旁側(cè)序列進(jìn)行了初步解析；在此基礎(chǔ)上建立了品系特異性定性PCR及定量PCR檢測(cè)方法,所建立的定性定量檢測(cè)方法穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高,各項(xiàng)參數(shù)滿足國(guó)際轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)技術(shù)要求。得到的主要結(jié)果如下:
　　 一、解析了轉(zhuǎn)cry1Ac基因

2、抗蟲(chóng)棉“鄂雜棉1號(hào)”的外源DNA插入結(jié)構(gòu),并通過(guò)GenomeWalking方法獲得了其外源基因插入位點(diǎn)處基因組序列信息。獲得的外源插入序列及其旁側(cè)序列的長(zhǎng)度為13198bp,其中1-11901bp屬于外源DNA序列,11902-13198bp屬于棉花基因組序列；插入片段包含1個(gè)完整拷貝的cry1Ac抗蟲(chóng)基因和1個(gè)完整拷貝的nptⅡ報(bào)告基因。
　　 二、基于轉(zhuǎn)cry1Ac基因抗蟲(chóng)棉“鄂雜棉1號(hào)”基因組DNA的一端旁側(cè)序列,分別建立

3、了品系特異性定性PCR及定量PCR檢測(cè)方法。其中,定性PCR檢測(cè)方法所設(shè)計(jì)引物對(duì)14-QF／14-F4的檢測(cè)靈敏度是43個(gè)拷貝,相當(dāng)于檢測(cè)極限為0.1％(以模板DNA為100ng計(jì))；初步試用結(jié)果表明,該定性檢測(cè)方法穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、靈敏度高,適用于“鄂雜棉1號(hào)”定性檢測(cè)。定量PCR檢測(cè)方法的定量限為50拷貝,檢測(cè)限為不大于50拷貝,這幾項(xiàng)參數(shù)的測(cè)試指標(biāo)可以滿足目前國(guó)際國(guó)內(nèi)5％-0.5％的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識(shí)閾值或檢測(cè)水平的需要。通過(guò)轉(zhuǎn)基因