利用Cre-lox重組系統(tǒng)篩選友好基因座.pdf

1、該實(shí)驗(yàn)擬利用Cre/lox系統(tǒng)來篩選出友好基因座,即在動(dòng)物細(xì)胞染色體上找到一個(gè)可以高效表達(dá)外源基因的"友好座位",以使外源基因在導(dǎo)入動(dòng)物體后能夠高效表達(dá)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)技術(shù)過程更有效、更容易.合成loxP和lox511位點(diǎn),將其同方向地克隆到載體pEGFP-1的多克隆位點(diǎn)之內(nèi),構(gòu)建成含有l(wèi)ox位點(diǎn)的通用載體——plox,然后將報(bào)告基因GFP及neo基因片段克隆到載體plox上的loxP和lox511序列之間,構(gòu)建成一基因打靶載體-ploxGF

2、P.將雞γ-干擾素cDNA克隆到載體plox上的loxP和lox511序列之間,構(gòu)建成另一打靶載體-ploxIFN.首先將質(zhì)粒ploxGFP DNA電轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞,并用G418篩選,篩選出綠色熒光細(xì)胞克隆,增殖培養(yǎng)之后,將質(zhì)粒ploxIFN和pBS185 DNA共轉(zhuǎn)染熒光細(xì)胞克隆,篩選出不發(fā)光的克隆.用PCR法檢測(cè)兩個(gè)不發(fā)光細(xì)胞克隆、發(fā)光細(xì)胞克隆及共轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)一周的細(xì)胞,并用質(zhì)粒ploxIFN、質(zhì)粒ploxGFP及?；蚪M作為對(duì)

3、照.引物設(shè)計(jì)的位置是在loxP和lox511之外的載體序列,整個(gè)載體序列都隨轉(zhuǎn)染而進(jìn)入細(xì)胞.經(jīng)PCR檢測(cè)后,有一個(gè)不發(fā)光細(xì)胞克隆擴(kuò)增出了與對(duì)照質(zhì)粒ploxIFN相同的約1000bp的條帶,表明發(fā)生了替換反應(yīng);另一個(gè)不發(fā)光細(xì)胞克隆認(rèn)為是在Cre重組酶的作用下其內(nèi)部自行發(fā)生了剪切作用,剪切了GFP基因,從而只擴(kuò)增出了載體序列和一個(gè)lox位點(diǎn)的約500bp的條帶.以綠色熒光細(xì)胞克隆為模板擴(kuò)增出了包括GFP基因、neo基因等在內(nèi)的約4kb的條帶