兼容CODIS與ESS核心基因座的24個基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的構(gòu)建與驗證及法庭科學(xué)應(yīng)用的研究.pdf

1、STR（短串聯(lián)重復(fù)）是一種廣泛用于司法實踐領(lǐng)域且行之有效的遺傳標(biāo)記，為便于數(shù)據(jù)庫內(nèi)及數(shù)據(jù)庫之間DNA數(shù)據(jù)比較，必須要統(tǒng)一所使用的核心基因座。自從1997年11月以來，美國FBI實驗室一直采用13個STR核心基因座上報國家數(shù)據(jù)庫，這13個CODIS核心基因座為D3S1358，D5S818，D7S820，D8S1179，D13S317,D16S539,D18S51,D21S11,FGA,TH01,TPOX,vWA。在歐洲，各個國家間也一直在

2、致力于將基因座統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程，2009年4月，歐洲法庭科學(xué)研究機(jī)構(gòu)（ENFSI）一致決定在已有的歐洲標(biāo)準(zhǔn)基因座(ESS)7個STR(D3S1358，D8S1179，D18S51，D21S11，F(xiàn)GA，TH01，vWA)基礎(chǔ)上，增加了另外5個STR基因座(D1S1656，D2S441，D10S1248，D12S391，D22S1045)，但是，這并沒有解決CODIS與ESS兼容的問題。目前，CODIS與ESS只有7個基因座重復(fù)，隨著國際

3、上各個國家之間的交流及DNA數(shù)據(jù)庫容量的增加，構(gòu)建一套既能便于數(shù)據(jù)共享又能降低隨機(jī)匹配數(shù)的核心基因座，是法庭科學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)展的必然趨勢。
　　本文研究構(gòu)建了一個新的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，可以同時熒光檢測23個STR基因座與1個性別基因座，涵蓋了美國CODIS與歐洲ESS所有核心基因座以及另外5個商品試劑盒中常用的基因座(D2S1338，D6S1043，D19S433，PentaD，PentaE)。24個基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)具有更高的個體識別能

4、力，實現(xiàn)了一次復(fù)合擴(kuò)增檢驗，獲得比其他方法更多的信息含量，滿足了法醫(yī)學(xué)親子鑒定及失蹤人口身源鑒定的需要。對血痕和口腔拭子打孔取樣，直接擴(kuò)增，且PCR反應(yīng)的整個時間少于90分鐘。
　　依據(jù)DNA分析方法科學(xué)工作組(SWGDAM)制訂的確證實驗指南[8]及中國國家標(biāo)準(zhǔn)(CNS)“法庭科學(xué)人類STR復(fù)合PCR檢驗試劑質(zhì)量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)”(GA/T815-2009)，從種屬特異性、靈敏性、穩(wěn)定性、精確性與準(zhǔn)確性、案件檢材適用性、遺傳多態(tài)性、混合

5、樣本及PCR方法學(xué)驗證等方面進(jìn)行測試，力求證明該24個基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)準(zhǔn)確、可靠、高效，適用于法庭科學(xué)人類個體識別。
　　材料與方法：
　　1、依據(jù)①中國法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫選用的基因座標(biāo)準(zhǔn)(GA469-2004)，②CODIS和ESS核心基因座，③兼容當(dāng)前商品試劑盒的常染色體STR基因座。
　　2、根據(jù)自GenBank(R)數(shù)據(jù)庫信息，應(yīng)用Primer3(v.0.4.0)和AutoDimer v1.1軟件設(shè)計引物并

6、對所選擇引物進(jìn)行二聚體檢測，所有熒光染料均標(biāo)記在引物的上游端。
　　3、以pUC18質(zhì)粒為模板，選取927至1425核苷酸位置，擴(kuò)增17個不同大小的片段，制備分子量內(nèi)標(biāo)。
　　4、以pUC18質(zhì)粒為模板，選取927至1425核苷酸位置，擴(kuò)增5個不同大小的片段并用不同熒光標(biāo)記，制備Matrix熒光校正品。
　　5、以群體遺傳學(xué)調(diào)查觀察到的不同等位基因個體DNA為模板，分別擴(kuò)增每個基因座，擴(kuò)增產(chǎn)物按比例混合、平衡，再以其稀

7、釋液為模板進(jìn)行擴(kuò)增，制備STR復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)的等位基因ladder。
　　6、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測靈長類動物（黑猩猩、狒狒、獼猴、狐猴）和非靈長類常見動物（狗、貓、鼠、豬、牛、羊、雞）以及微生物（白色念珠菌、酵母菌、大腸桿菌、糞腸球菌、具核梭桿菌、乳酸桿菌、滕黃微球菌、綠膿桿菌、表皮葡萄球菌、唾液鏈球菌），驗證系統(tǒng)的種屬特異性。
　　7、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測稀釋成4ng、2 ng、1 ng、500 pg、250 pg、

8、125 pg、63 pg、32 pg、16 pg、8 pg的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品，檢測系統(tǒng)的靈敏度。
　　8、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測含不同濃度常見抑制因素（血紅素、腐殖酸、EDTA、SDS、乙醇、咖啡、茶、牛奶、醬油、糖、煙蒂），驗證系統(tǒng)的穩(wěn)定性。
　　9、使用176份等位基因ladder樣本，分別在3130xl和3730遺傳分析儀上電泳分析，通過等位基因ladder中等位基因片段長度在不同儀器不同run中的平均值和標(biāo)

9、準(zhǔn)差，來評估本復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在3130xl遺傳分析儀及3730 DNA分析儀上進(jìn)行基因分型的準(zhǔn)確性。
　　10、收集46份無關(guān)個體血痕樣本，分別在3130xl和3730遺傳分析儀上電泳分析，通過計算樣本等位基因片段長度與等位基因ladder中等位基因片段長度的差值，來評估本復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)在3130xl遺傳分析儀及3730 DNA分析儀上基因分型的精確性。
　　11、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測不同的案件樣本，驗證系統(tǒng)的適用性。

10、>　　12、用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)、商品化試劑盒（PowerPlex(R) Fusion系統(tǒng)、PowerPlex(R)18D系統(tǒng)、AmpFLSTR(R)SinoFilerTM試劑盒及AmpFLSTR(R) NGMTM試劑盒檢測美國國家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)研究所DNA分型標(biāo)準(zhǔn)品SRM2391c及群體樣本中的276份，驗證系統(tǒng)的一致性。
　　12、2800M與9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品定量后，按照1∶0、9∶1、4∶1、1∶1、1∶4、1∶9、0∶1

11、不同比例混合，使混合后總的DNA模板量為1ng，用構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測，驗證系統(tǒng)對混合樣本的檢測能力。
　　13、用6.25μl、12.5μl、25μl的擴(kuò)增體系，分別對模板量100 pg、250 pg、500 pg、1 ng的9948 DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的確證。
　　14、用1ng的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，用于PCR循環(huán)參數(shù)（退火溫度、最后延伸溫度和時間、循環(huán)次數(shù)）的評估。STR基因座圖譜

12、的完整性、平均峰高值、均衡性等作為評價系統(tǒng)的性能指標(biāo)。
　　15、分別以0.5×，0.75×，1.25×及1.5×PCR組份，檢測1ng的9948男性DNA標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行PCR反應(yīng)成分的確證。
　　16、用群體樣本驗證系統(tǒng)的stutter、均衡性與丟峰率。
　　17、應(yīng)用新構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)對北方漢族547例無關(guān)個體血痕樣本進(jìn)行檢測。統(tǒng)計分析23個STR基因座遺傳多態(tài)性及相關(guān)法醫(yī)學(xué)參數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1、

13、成功構(gòu)建5色熒光標(biāo)記的24個基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，并能在3130xl、3730等遺傳分析儀上應(yīng)用。PCR反應(yīng)時長68分鐘，直接擴(kuò)增血痕與口腔拭子樣本得到完整分型。
　　2、依據(jù)SWGDMA指南和CNS(GA/T815-2009)標(biāo)準(zhǔn)的驗證實驗顯示，復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)靈敏度為125 pg～2ng，具有良好的種屬特異性、穩(wěn)定性、精準(zhǔn)性和準(zhǔn)確性，對案件檢材具有良好的適用性，與商品化試劑盒分型比較呈現(xiàn)完整的一致性，可應(yīng)用于一定范圍內(nèi)的混合樣品分析

14、，對于反應(yīng)體積、循環(huán)參數(shù)、反應(yīng)成分變化具有一定程度的耐受性，stutter的百分比＜15％，基因座內(nèi)均衡性＞87％、同一熒光標(biāo)記均衡性＞60％、不同熒光標(biāo)記均衡性＞30％，在峰高50RFU、150RFU、450RFU下，丟峰率分別為0.18、0.09、0.01。
　　3、在群體研究中，除CSF1PO、D3S1358、TH01、TPOX外，其余STR基因座均呈高雜合性(He＞0.7)、高個體識別能力(DP＞0.9)、高多態(tài)性信息含量

15、(PIC＞0.7)。累積個體識別率(TDP)、無關(guān)個體偶和概率(TPI)、累積非父排除率(CPE)分別為0.999999999999999999999999999265、7.35×10-28和0.999996847。DNA數(shù)據(jù)庫隨機(jī)匹配概率，在547個樣本容量內(nèi)低至1.10×10-22，在中國DNA數(shù)據(jù)庫（容量約1200萬）為5.29×10-14。
　　結(jié)論：
　　1、本研究構(gòu)建并驗證了5色熒光標(biāo)記的24個基因座復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)

16、，聯(lián)合CODIS與ESS核心基因座，極大降低DNA數(shù)據(jù)庫隨機(jī)匹配人數(shù)，提高數(shù)據(jù)庫搜索精度;增強(qiáng)數(shù)據(jù)庫兼容性，便于國際數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分享;提高了個體識別能力，更加適用于失蹤人口身源鑒定。其中9個基因座擴(kuò)增片段長度＜200 bp，有助于降解檢材獲得更多的基因分型。復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)檢測和分析均基于現(xiàn)有儀器和軟件，不必進(jìn)行購買升級，節(jié)省成本，更適合于發(fā)展中國家或者市區(qū)級地方建庫的需要。
　　2、本研究構(gòu)建的復(fù)合擴(kuò)增系統(tǒng)，PCR時長縮短為68分鐘并