海水魚源高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選及其酶學(xué)特性的初步研究.pdf

1、中國(guó)海洋面積廣闊、魚類資源豐富，品種繁多。海洋微生物作為海洋資源的重要組成部分，越來(lái)越成為人們的關(guān)注熱點(diǎn)。蛋白酶由于其廣泛的應(yīng)用，已成為目前需求量最大的一種酶類。與傳統(tǒng)蛋白酶相比，微生物蛋白酶具有生產(chǎn)周期短、成本低、易控制等特點(diǎn)，微生物日益成為工業(yè)酶制劑的來(lái)源。海洋魚類生長(zhǎng)環(huán)境與淡水環(huán)境差異大，氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成具有獨(dú)特性，因此尋找并開發(fā)海洋魚源的產(chǎn)蛋白酶微生物，進(jìn)一步掌握新型微生物和蛋白酶的相關(guān)特性，具有重要的科研及商業(yè)價(jià)值。

2、>　　本研究以海洋來(lái)源的魷魚、馬鮫魚為研究對(duì)象，篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株。通過(guò)檢測(cè)蛋白酶產(chǎn)生水解圈結(jié)合蛋白酶活性測(cè)定的方法篩選高產(chǎn)蛋白酶菌株，采用PCR技術(shù)對(duì)篩選菌株進(jìn)行16 S rRNA鑒定，并構(gòu)建目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)高產(chǎn)蛋白酶菌株的培養(yǎng)基成分進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，同時(shí)初步研究其粗蛋白酶的酶學(xué)特性。從魷魚和馬鮫魚中篩選得到16株具有較高產(chǎn)蛋白酶能力的菌株，經(jīng)16 S rRNA鑒定屬于芽孢桿菌屬（B

3、acillus sp.）、普羅威登斯菌屬（Providencia sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.），其中SW5菌株產(chǎn)酶活性最高，達(dá)到257.67±2.44 U/mL，經(jīng)鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。在單因素的基礎(chǔ)上，對(duì)目的菌株 SW5的培養(yǎng)基組成進(jìn)行雙響應(yīng)面優(yōu)化，得到其培養(yǎng)基組成為：葡萄糖2.95％、大豆蛋白胨1.30%、CaCl20.20%，該模型蛋白酶活力的最大

4、響應(yīng)值為312.98U/mL，進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)值是預(yù)測(cè)值的98.73%，SW5菌株的產(chǎn)蛋白酶活力較優(yōu)化前提高了21.5%。當(dāng)NaCl濃度為4%時(shí)菌株產(chǎn)蛋白酶活力最高。對(duì) SW5菌株的產(chǎn)酶特性的初步研究，發(fā)現(xiàn)其粗蛋白酶最適 pH為8.0，pH8.0～10.0時(shí)酶較穩(wěn)定；最適溫度為40℃，在30～50℃時(shí)具有較高酶活性，在35℃下保溫60 min后，仍保留80%以上的活性；金屬離子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)終離子濃度為1 mmol/L時(shí)，Mn2+、B

5、a2+和 Ca2+對(duì)該菌株所產(chǎn)蛋白酶的酶活力均有較高的激活作用，F(xiàn)e2+和 Zn2+有明顯抑制作用，可以初步判斷菌株SW5產(chǎn)蛋白酶為堿性蛋白酶。共篩選出3個(gè)屬的產(chǎn)蛋白酶菌株，尤其是普羅威登斯菌屬（Providencia sp.）豐富了產(chǎn)蛋白酶微生物資源。隨著“海上絲綢之路”的提出與深化，海洋魚類微生物是一個(gè)急待開發(fā)利用、重中之重的生物菌庫(kù)，開發(fā)新型海洋微生物，研究其對(duì)人類生活的應(yīng)用價(jià)值，是一項(xiàng)非常重要的工作，對(duì)于擴(kuò)大對(duì)未知微生物種群的認(rèn)