團(tuán)頭魴EST-SSR的開發(fā)及在育種中的應(yīng)用.pdf

1、團(tuán)頭魴(MegahbramaamblycephalaYih)，俗稱武昌魚，屬硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、鲌亞科。自然分布區(qū)域狹窄，原產(chǎn)僅在長江中游的一些通江湖泊，如湖北省的梁子湖、淤泥湖和江西的鄱陽湖等。由于其獨(dú)特的文化元素以及具有草食性、成活率高、生長較快、抗病力強(qiáng)、含肉率高及營養(yǎng)價(jià)值較高等優(yōu)點(diǎn)，在20世紀(jì)60年代已確認(rèn)為一種優(yōu)良養(yǎng)殖魚類。目前已經(jīng)推廣到全國各地飼養(yǎng)，成為我國池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要或者混養(yǎng)魚類之一。由于人工繁殖的成功突破和養(yǎng)

2、殖馴化水平的不斷提高，在2010年團(tuán)頭魴在我國的養(yǎng)殖產(chǎn)量已經(jīng)達(dá)到652，215t(CAFS，2010)。然而，隨著養(yǎng)殖馴化過程中的近親繁殖、野生資源的過度捕撈以及生存環(huán)境的破壞，團(tuán)頭魴的種質(zhì)資源已經(jīng)受到了嚴(yán)重的威脅。團(tuán)頭魴的養(yǎng)殖群體逐漸出現(xiàn)了生長減緩、體型變長變薄、抗病力差和性成熟個(gè)體變小等問題。
　　目前團(tuán)頭魴分子遺傳基礎(chǔ)薄弱、基因序列和分子標(biāo)記資源匱乏、遺傳育種理論尚不成熟，嚴(yán)重影響團(tuán)頭魴遺傳育種計(jì)劃的開展。為了更加有效地開展

3、團(tuán)頭魴先進(jìn)的育種計(jì)劃，盡快培育出優(yōu)良品種，本論文從團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組高通量測序入手，開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記，構(gòu)建親子鑒定技術(shù)平臺(tái)，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合團(tuán)頭魴F1代生長表型數(shù)據(jù)進(jìn)行了全面的數(shù)量遺傳學(xué)研究。在本論文結(jié)合數(shù)量遺傳學(xué)、雜交育種和MAS等多方面知識(shí)，運(yùn)用了家系選育、群體選擇、BLUP育種和后裔測定等多種方法開展團(tuán)頭魴的育種研究，為早日獲得團(tuán)頭魴具有生長優(yōu)勢的優(yōu)良品種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?？偟膩碚f主要有如下結(jié)果和結(jié)論:
　　1.團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組454G

4、SFLX高通量測序和分析
　　應(yīng)用高通量454測序技術(shù)對(duì)團(tuán)頭魴多個(gè)組織的均一化cDNA文庫進(jìn)行測序，一共獲得了1，409，706條高質(zhì)量序列，總長度為577Mbp，平均長度為411bp。經(jīng)過拼接組裝后獲得了26，802條contigs和73，675條singletons，測序深度大約為7.6倍。Contigs的平均長度達(dá)730bp，且有74.1％的contigs序列長度超過500bp。對(duì)團(tuán)頭魴拼接得到的unigenes與Nr、Sw

5、iss-prot和UniProt等公共蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫比對(duì)，超過50％的序列獲得了注釋;通過GO注釋對(duì)基因進(jìn)行分類，獲得了zincionbingding等41個(gè)小類別，鑒別出大量與生長、繁殖、免疫和抗逆等相關(guān)性狀的候選基因。通過與斑馬魚、青鯔、綠河豚、河豚、三棘刺魚、人、小鼠和雞的基因組比較，發(fā)現(xiàn)團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組中的基因與這些物種具有很高的比例的相似度，同時(shí)還鑒定了778條的團(tuán)頭魴特有的基因。另外，在團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組中一共檢測到有4，952個(gè)SSR

6、位點(diǎn)和大量的SNP位點(diǎn)(25，697個(gè))和插入缺失位點(diǎn)(23，287個(gè))。
　　2.根據(jù)團(tuán)頭魴轉(zhuǎn)錄組EST序列，開發(fā)大量微衛(wèi)星標(biāo)記
　　EST文庫篩選微衛(wèi)星具有方法簡便、花費(fèi)較低等特點(diǎn)。本研究從團(tuán)頭魴454轉(zhuǎn)錄組測序得到的大量isotigs序列中搜索SSR位點(diǎn)，一共隨機(jī)設(shè)計(jì)了300對(duì)EST-SSR引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳分型，其中146個(gè)位點(diǎn)(48.7％)可以清晰擴(kuò)增出條帶，93個(gè)(31％)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有多態(tài)

7、性。多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記應(yīng)用于梁子湖野生樣本的遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)有效等位基因數(shù)從2到18個(gè)，平均等位基因數(shù)為5.11個(gè)。觀測雜合度（HO）的大小在0.25到1之間，平均為0.69;期望雜合度(HE)在0.25到0.86之間，平均為0.65。此外，從所開發(fā)出的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記中，篩選20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)構(gòu)建了6個(gè)多重PCR反應(yīng)體系，高效地分析團(tuán)頭魴淤泥湖野生群體群體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性較低，并且在多個(gè)位點(diǎn)上顯著偏離哈迪-溫伯格平衡，說

8、明了該團(tuán)頭魴野生群體遭到了嚴(yán)重的干擾。
　　3.利用高質(zhì)量多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建親子鑒定技術(shù)體系
　　基于微衛(wèi)星的親子鑒定技術(shù)的使用克服了傳統(tǒng)選育過程中的種種弊端。本研究利用8個(gè)高質(zhì)量多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建了團(tuán)頭魴親子鑒定平臺(tái)，平均等位基因?yàn)?0個(gè)，平均觀測雜合度和期望雜合度分別是0.649和0.670，多態(tài)信息含量是0.655，在混養(yǎng)家系鑒定中準(zhǔn)確率達(dá)到96.33％，可以實(shí)現(xiàn)團(tuán)頭魴多個(gè)家系從出生就可以進(jìn)行混養(yǎng)，成功地減少管理

9、成本，增加家系數(shù)量，同時(shí)大大降低環(huán)境誤差，從而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)如家系生長性能評(píng)估、雜交優(yōu)勢和遺傳參數(shù)評(píng)估等多個(gè)方面的研究更加精確地進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)，提高選育效率，加快育種進(jìn)程。
　　4.團(tuán)頭魴子一代優(yōu)良家系篩選
　　本研究通過收集團(tuán)頭魴自然群體，然后進(jìn)行群體繁育的方法，構(gòu)建了團(tuán)頭魴317個(gè)F1代全同胞家系。F1代從魚苗下塘開始就一起混合飼養(yǎng)，直到收獲(20月齡)時(shí)，利用微衛(wèi)星的親子鑒定技術(shù)進(jìn)行家系鑒定。通過鑒定，708個(gè)子代(94.

10、53％)能夠準(zhǔn)確地找到單一的父母本。結(jié)合F1代的生長性狀表型值，成功篩選到了平均體重≥400g的家系的25個(gè)，其中36號(hào)、41號(hào)和1號(hào)家系生長最快，這些家系可以作為團(tuán)頭魴家系育種的重要選育系。另外，根據(jù)多個(gè)生長最快的家系和生長最慢的家系的體長和體重建立關(guān)系式，分別為W=0.1059*L2.5224(R2=0.9035)和w=0.1117*L2.4608(R2=0.9106)。兩關(guān)系式中a值相近，說明不同家系的生長環(huán)境較穩(wěn)定，家系之間具有

11、可比性;b＜3，說明兩組家系均處于異速生長階段，符合團(tuán)頭魴正常的生長規(guī)律。
　　5.團(tuán)頭魴雜交優(yōu)勢和配合力分析
　　本研究對(duì)團(tuán)頭魴梁子湖(LZ)、淤泥湖(YN)和鄱陽湖(PY)3個(gè)地理種群進(jìn)行雙列雜交實(shí)驗(yàn)，采用親本多雌配多雄的人工繁殖方法構(gòu)建團(tuán)頭魴F1家系，F(xiàn)1代在混合養(yǎng)殖的條件下，通過親子鑒定的手段來比較各個(gè)繁殖組合20月齡的生長性狀，評(píng)估了三個(gè)地理種群的配合力和雜交優(yōu)勢。結(jié)果表明，在總體水平上父本對(duì)于體重的一般配合力大大

12、高于母本;不管是父本還是母本，LZ群體的一般配合力都是最大的;YN♀×PY♂的特殊配合力最大，雜交優(yōu)勢明顯，可見種內(nèi)群體間雜交是培育團(tuán)頭魴優(yōu)良新品系的重要方法之一。除此之外，團(tuán)頭魴子一代的生長性狀與親本群體的遺傳多樣性指數(shù)在一定范圍內(nèi)存在顯著性線性正相關(guān)關(guān)系，其中體重與親本群體期望雜合度的關(guān)系式為y=600.7x-29.472(r=0.8651,p=0.0026)。
　　6.團(tuán)頭魴20月齡遺傳參數(shù)和育種值估計(jì)
　　本研究采用

13、混合家系遺傳參數(shù)估計(jì)法對(duì)20月齡團(tuán)頭魴F1代的生長相關(guān)性狀（體重、體長、全長和體高）的遺傳參數(shù)和育種值進(jìn)行了估計(jì)。利用SPSS19軟件的一般線性模型(GLM)計(jì)算表型變量的方差組分，估計(jì)生長相關(guān)性狀的遺傳力。結(jié)果顯示團(tuán)頭魴20月齡的生長相關(guān)性狀的遺傳力在0.50～0.65之間，表明在加性效應(yīng)控制下，團(tuán)頭魴的生長性狀具有較大的遺傳改良潛力;遺傳相關(guān)在0.98～1之間，說明團(tuán)頭魴生長相關(guān)性狀緊密連鎖，在選育實(shí)踐中可以只針對(duì)一個(gè)性狀進(jìn)行選育，

14、如體重或體長，節(jié)約操作時(shí)間和降低成本。此外，本研究采用BLUP法估計(jì)了團(tuán)頭魴生長相關(guān)性狀的育種值和考慮團(tuán)頭魴體型因素的綜合育種值。單性狀（體重或體長）的育種值與綜合育種值排名相比較差異不大。育種值排名靠前的親本絕大部分來自梁子湖和鄱陽湖，說明這兩個(gè)湖泊的親本比較優(yōu)秀。
　　7.團(tuán)頭魴親本對(duì)子代的貢獻(xiàn)及優(yōu)良親本篩選
　　本研究通過利用9對(duì)微衛(wèi)星親子鑒定技術(shù)研究親本對(duì)子代群體的貢獻(xiàn)及篩選優(yōu)良親本。通過微衛(wèi)星標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，子代生長

15、快和生長慢群體的FST較大(0.024，P＜0.0343)，說明了通過表型選擇會(huì)引起團(tuán)頭魴子代群體間顯著性的遺傳差異。經(jīng)過親子鑒定分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于子代生長快群體和生長慢的群體，不是所有親本均有貢獻(xiàn)，在生長快和生長慢群體的有效群體數(shù)量比親本顯著降低，分別約為65和67尾。生長快和生長慢群體的近交系數(shù)分別約為0.77％和0.75％，這兩個(gè)值高于親本群體的近交系數(shù)。另外，經(jīng)過親本對(duì)生長快和生長慢群體的貢獻(xiàn)分析，發(fā)現(xiàn)15個(gè)親本(6個(gè)母本和9個(gè)父本