大麥半矮稈基因sdw1-denso的克隆與功能分析.pdf

1、半矮稈基因廣泛用于大麥育種。迄今，已報導(dǎo)過30多種大麥矮稈基因。其中sdw1/denso半矮稈基因在歐美、澳大利亞等國家大量應(yīng)用，是大麥育種中應(yīng)用最成功的基因之一。而我國大麥矮稈育種上應(yīng)用的主要基因是uzu1基因。sdw1/denso基因在不同環(huán)境條件下能使株高降低10-20 cm。此外，該基因與遲抽穗、晚熟、降低千粒重和高過篩率相關(guān)。sdw1/denso基因?qū)Ξa(chǎn)量的影響因遺傳背景而異?；趕dw1/denso基因適宜的株高和潛在的增產(chǎn)

2、效應(yīng)，故已被轉(zhuǎn)入至許多大麥品種。目前，至少有4個sdw1/denso等位基因被先后報導(dǎo)。值得關(guān)注的是，denso基因主要用于啤酒大麥育種，而sdw1基因主要用于飼料大麥育種。綜上所述，有必要克隆sdw1/denso基因，以闡明其矮稈機制，揭示該基因?qū)r(nóng)藝性狀的影響，從而更好地應(yīng)用于大麥育種。現(xiàn)將本文的主要研究及取得的結(jié)果介紹如下:
　　1.大麥sdw1/denso候選基因的克隆
　　比較基因組學(xué)表明，大麥sdw1/denso

3、基因位于與水稻1號染色體sd1基因染色體存在共線性區(qū)域，而水稻sd1基因編碼GA20-氧化酶。通過PCR法在大麥中獲得部分水稻sd1基因的同源序列，并將其命名為HvGA20ox2。利用獲得的部分序列BLAST Gramene網(wǎng)站(http://www.gramene.org/)獲得HvGA20ox2全長序列。通過比較，發(fā)現(xiàn)大麥HvGA20ox2與水稻sd1具有相同的基因結(jié)構(gòu)，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。預(yù)測的HvGA20ox2蛋白序列與

4、小麥GA20ox2b和粗山羊草的GA20ox2相似性分別達94.1％和95.7％。測序分析大麥denso品種Baudin和高稈品種AC Metcalfe的HvGA20ox2基因，發(fā)現(xiàn)了一個SNP標(biāo)記和InDel標(biāo)記。這兩個標(biāo)記在178個Baudin×AC Metcalfe DH株系中共分離，同時將HvGA20ox2基因定位于大麥3HL染色體。以上結(jié)果表明，sdw1/denso基因可能是水稻sd1的同源基因。HvGA20ox2基因的克隆有

5、助于了解sdw1/denso基因的矮稈機制，并為sdw1/denso基因的篩選提供了診斷標(biāo)記。
　　2.HvGA20ox2基因的表達與大麥農(nóng)藝和品質(zhì)性狀的關(guān)系
　　半定量RT-PCR表明，HvGA20ox2基因在大麥各組織器官中都有不同程度的表達。denso基因型品種Baudin的葉片、葉鞘，莖、穗軸和幼穗中，HvGA20ox2基因的轉(zhuǎn)錄水平呈不同程度的降低。利用qRT-PCR檢測Baudin×AC MetcalfeDH群體

6、中HvGA20ox2基因的表達量并進行QTL定位分析，結(jié)果僅在3H染色體HvGA20ox2基因區(qū)域獲得一個eQTL。研究還發(fā)現(xiàn)該eQTL與株高、產(chǎn)量、發(fā)育指數(shù)、容重和籽粒飽滿度QTL重疊，表明可能是HvGA20ox2基因的多效性影響大麥農(nóng)藝和品質(zhì)性狀。根據(jù)QTL定位和基因表達與性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，在Baudin×AC Metcalfe DH群體中，HvGA20o2基因低表達量除降低株高外，還提高產(chǎn)量。由于sdw1/denso基因與

7、低粒重和高過篩率相關(guān)，同時該群體中高稈和矮稈品種的穗長相當(dāng)，因此認為，該矮稈基因可能通過增加有效分蘗而提高產(chǎn)量。
　　3.sdw1/denso等位基因的鑒定和功能分析
　　PCR擴增sdw1/denso突變體的HvGA20ox2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個sdw1突變體Jotun和Riso no.9265中HvGA20ox2基因完全缺失。測序分析denso突變體的HvGA20ox2基因，發(fā)現(xiàn)其1號外顯子中缺失7 bp(GACTCCC)

8、。利用7bp缺失設(shè)計了插入缺失分子標(biāo)記InDel-denso，可以有效區(qū)分denso和sdw1突變體。利用該標(biāo)記檢測了535份大麥品種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)denso基因已應(yīng)用于我國甘肅和云南的大麥育種。此外，還獲得一個鑒定denso和sdw1等位基因的基因表達標(biāo)記(GEM)。通過檢測HvGA20ox2基因的旁鄰基因，發(fā)現(xiàn)兩個不同來源的sdw1突變體Jotun和Riso no.9265缺失片段不同。Riso no.9265突變體中Morex_con

9、tig_40861（包括HvGA20ox2和Mloc_56463基因）完全缺失。而Jotun突變體至少缺失包括Morex_contig_40861在內(nèi)的5個基因。因此，可用Morex_contig_40861的旁鄰基因鑒定Jotun和Riso no.9265等位基因。上述HvGA20ox2基因在不同sdw1/denso突變體中的變異，進一步表明sdw1/denso就是HvGA20ox2基因。
　　denso突變體中，7bp缺失的H

10、vGA20ox2基因內(nèi)部還有一轉(zhuǎn)錄起始位點，可能編碼產(chǎn)生一新蛋白，但仍然具有2-酮戊二酸和GA底物結(jié)合有關(guān)的保守序列。因此denso基因至少具有部分GA20-氧化酶的功能。相反，sdw1突變體中，HvGA20ox2基因完全缺失，表明突變體內(nèi)缺失某一GA20-氧化酶。因此，可以認為denso突變體仍能廣泛應(yīng)用于啤酒大麥育種，可能是因為體內(nèi)赤霉素含量的輕微變化不足以影響品質(zhì);而sdw1突變體由于體內(nèi)赤霉素降低太多而只能用于飼料大麥育種。

11、r>　　4.HvGA20ox2基因功能分析
　　通過分析拔節(jié)期Bomi和突變體Riso no.9265莖中GA雙加氧酶的表達，發(fā)現(xiàn)突變體中HvGA20ox1和HvGA3ox2基因的表達量明顯上調(diào)，而HvGA2ox3基因的表達量明顯下調(diào)。這可能是由于Riso no.9265突變體中HvGA20ox2基因缺失造成體內(nèi)活性GA降低引起的。擬南芥中HvGA20ox2基因超表達引起赤霉素過量表型，特征是胚軸和莖伸長、早開花和高生長速率。此外

12、大麥HvGA20ox2基因能使擬南芥半矮稈突變體ga5-3表型恢復(fù)。與對照相比，HvGA20ox2轉(zhuǎn)基因擬南芥中GA含量增加，尤其是GA1+3。轉(zhuǎn)基因擬南芥赤霉素含量的變化與表型的變化相應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中AtGA20ox1、AtGA20ox2和AtGA3ox1基因表達量降低，而AtGA2ox2基因表達量增加，而ga5-3突變體正好相反，這可能是由于轉(zhuǎn)基因植株中活性GA增加而ga5-3中活性GA降低引起的負反饋作用。這些結(jié)果表明