溶酶體參與LDL促牛顆粒細胞StAR基因表達和孕酮合成的研究.pdf

1、近些年來，隨著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，奶牛的單產(chǎn)水平逐年提升。然而隨之也帶來了很多問題，其中奶牛產(chǎn)后繁殖力下降最為突出。很多高產(chǎn)奶牛產(chǎn)后出現(xiàn)不發(fā)情、發(fā)情表現(xiàn)不足或受胎率下降等情況，導致高產(chǎn)牛群后代數(shù)量下降，奶牛胎間距增大，養(yǎng)殖企業(yè)成本增加利潤下降。生殖激素對于調(diào)節(jié)奶牛發(fā)情周期和妊娠具有非常重要的作用，并且一直以來對其調(diào)節(jié)機制進行了大量研究和應(yīng)用，但是盡管如此也沒有從根本上解決奶牛產(chǎn)后繁殖力下降的問題。奶牛在產(chǎn)后30天開始進入產(chǎn)奶高峰期，而

2、直到產(chǎn)后90天奶牛才開始進入采食高峰期，這一段時期奶牛的能量就處于能量負平衡狀態(tài)。然而奶牛產(chǎn)后60至90天正是參配的最佳時期。有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛在泌乳期或營養(yǎng)不足的情況下，steroidogenic acute regulatory protein(StAR)基因的表達被下調(diào)。該基因被下調(diào)將直接導致卵巢孕酮合成水平下降，如果奶牛此時參配則將導致受胎率下降。這一研究結(jié)果提示，某些營養(yǎng)物質(zhì)可能參與了奶牛產(chǎn)后發(fā)情和受孕的調(diào)節(jié)。低密度脂蛋白(Lo

3、w Density Lipoprotein，LDL)一直以來被視為營養(yǎng)物質(zhì)或類固醇激素合成底物。越來越多的研究證實低密度脂蛋白對孕酮合成具有刺激作用。而低密度脂蛋白調(diào)節(jié)StAR基因表達的證據(jù)僅在小鼠的非卵巢細胞中被發(fā)現(xiàn)。然而在顆粒細胞中低密度脂蛋白是否具有類似的調(diào)節(jié)StAR基因表達的作用仍未有報道。而對這一問題的研究將有助于理解體內(nèi)卵泡排卵后，低密度脂蛋白在顆粒細胞向黃體細胞分化過程中對其功能轉(zhuǎn)變的作用。
　　本研究在體外培養(yǎng)牛顆

4、粒細胞，利用含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)的DMEM/F12培養(yǎng)液處理顆粒細胞24h后與對照組（未添加低密度脂蛋白）進行比較。利用孕酮放免試劑盒分析兩組培養(yǎng)液中的孕酮含量，結(jié)果顯示低密度脂蛋白組產(chǎn)生的孕酮（155.61±35 ng/105細胞）明顯多于對照組（30.31±6.2ng/105細胞;p＜0.05）;熒光定量PCR結(jié)果顯示，低密度脂蛋白上調(diào)了顆粒細胞StAR和P450scc的mRNA表達量，分別比對照

5、組提高2.29和2.33倍(p＜0.05);利用Western blot技術(shù)分析結(jié)果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理后，顆粒細胞中StAR蛋白表達水平較未經(jīng)處理的對照組顆粒細胞提高2.71倍(p＜0.05);利用油紅對兩組顆粒細胞進行染色，結(jié)果顯示經(jīng)低密度脂蛋白處理的顆粒細胞中積累的脂滴數(shù)量為124.3±24.3/細胞，明顯多于未經(jīng)處理的對照組中的脂滴數(shù)量(40.6±12/細胞;p＜0.01);另外，本實驗將奶牛發(fā)情中期黃體內(nèi)的黃體細胞(lute

6、al cells，LC)分離出來并原代培養(yǎng)后，使用油紅染色并與前兩組進行對比，結(jié)果顯示黃體細胞中脂滴數(shù)量（354.1±27.9/細胞，p＜0.01）明顯多于顆粒細胞的對照組和低密度脂蛋白處理組;為了研究溶酶體在這個過程中的變化，我們分別使用了LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色對兩組細胞中溶酶體形態(tài)進行分析，結(jié)果顯示LAMP1免疫熒光染色后低密度脂蛋白處理組中的LAMP1熒光強度(0.93±0.02)明顯高于對照組(0.57±0.14

7、; p＜0.05)，同樣地，吖啶橙(acridine orange，AO)染色也顯示低密度脂蛋白處理組中的溶酶體數(shù)量（58.2±5.5/細胞）明顯多于對照組（25.4±3.0/細胞;p＜0.05）;另外，本實驗還對奶牛發(fā)情中期黃體中分離得到的黃體細胞在原代培養(yǎng)后，進行LAMP1免疫熒光染色和吖啶橙活體染色，并與前兩組進行對比，結(jié)果顯示黃體細胞中存在著大量的溶酶體，而其無論是LAMP1熒光強度(3.71±0.05)還是吖啶橙活體染色的溶酶

8、體數(shù)量（301.7±5.0/細胞），均高于或多于(p＜0.05)對照組和低密度脂蛋白處理組的顆粒細胞。
　　為了研究溶酶體在低密度脂蛋白誘導的顆粒細胞StAR表達和孕酮合成過程的作用，本實驗將培養(yǎng)的細胞分成三組，即對照組、低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)處理組和低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)與氯喹(chloroquine，CQ)(50μmol/L)混合處理組。孕酮檢測結(jié)果顯示，添加低密度脂

9、蛋白和氯喹處理的顆粒細胞所產(chǎn)生的孕酮量(19.2±7.5ng/105細胞)與對照組（27±4.7ng/105細胞）無明顯差異(p＞0.05)，但是這兩組明顯少于只添加低密度脂蛋白處理的顆粒細胞所產(chǎn)生的孕酮量（178.5±9.4ng/105細胞;p＜0.05）;同時，Western blot結(jié)果表明當氯喹被添加到培養(yǎng)液中時，低密度脂蛋白對顆粒細胞StAR蛋白質(zhì)表達的刺激作用受到了明顯抑制，即其表達水平明顯低于單獨添加低密度脂蛋白組(p＜0

10、.05)，而與對照組處于相似水平(p＞0.05)。另外，為了研究細胞內(nèi)膽固醇內(nèi)穩(wěn)態(tài)對溶酶體數(shù)量的影響，本實驗將培養(yǎng)的顆粒細胞分成兩組細胞，向其添加含有60μmol/L膽固醇(Cholesterol)的培養(yǎng)液預處理顆粒細胞1小時，然后分別更換只含有低密度脂蛋白(20μgof protein/ml)以及含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)和膽固醇(60μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。LAMP1免疫熒光分析顯示

11、，與單獨添加低密度脂蛋白組的LAMP1的平均熒光密度(0.93±0.02)相比，添加膽固醇和低密度脂蛋白組的LAMP1平均熒光密度(0.39±0.01; p＜0.05)明顯減少;同樣地，吖啶橙活體染色結(jié)果顯示，膽固醇阻止了低密度脂蛋白刺激的溶酶體增多，添加膽固醇和低密度脂蛋白組顆粒細胞中的溶酶體平均數(shù)量（34.9±4.29/細胞）明顯少于單獨添加低密度脂蛋白組（75±8.25/細胞;p＜0.05）。因此，我們的結(jié)果表明，低密度脂蛋白通過