人類新基因pp5644的功能研究以及酵母雙雜交載體的改造與文庫構建.pdf

1、復旦大學博士學位論文人類新基因pp5644的功能研究以及酵母雙雜交載體的改造與文庫構建姓名：葉曉霞申請學位級別：博士專業(yè)：遺傳學指導教師：霍克克20061015復旦大學博士學位論文中文摘要論文摘要本論文分為兩個部分：與肝癌相關的人類新基因pp56“的生物學功能研究以及酵母雙雜交系統(tǒng)載體質(zhì)粒的改造與文庫構建。在論文的第一部分，我們對人類新基因pp5644及其生物學功能進行了研究。pp5644基因編碼一個124aa的蛋白，生物信息學分析提示

2、它可能存在一個信號肽和coiled—coil結構。MTC—PCR表明，除了骨骼肌和胰腺外，pp5644在所檢測的其他14種組織中都有表達，其中在腦、腎和卵巢組織表達最高。細胞定位結果表明pp5644主要呈點狀、不均勻分布于細胞質(zhì)中。細胞生長曲線和集落形成實驗都表明pp5644基因的過量表達能夠抑制腫瘤細胞株的生長。通過酵母雙雜交篩選，我們得到了三個能夠與pp5644發(fā)生相互作用的已知蛋白：4一磷酸肌醇接頭蛋白1相關蛋白FASPl(FAP

3、P卜associatedprotein1)；NFKB關鍵調(diào)節(jié)因子NEM0(NFKBessentialⅢ0dulater)，也被稱為IKKY；bZIP轉錄園子池fF(Homosapiensv—mafmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehoIn0109F)。酵母maitng實驗、體外GSTPulldown實驗和體內(nèi)免疫共沉淀實驗驗證了這些相互作用的特異性。免疫熒光共定位實驗顯示pp5644與FAsPl

4、能夠共定位于細胞質(zhì)。而pp5644與MafF的細胞共定位實驗則表明，當MafF與pp5644共同表達時，兩者的細胞分布都發(fā)生了顯著改變，MafF由細胞核內(nèi)的均勻彌散分布變?yōu)橐欢ǖ暮巳蕝^(qū)聚集，pp5644由細胞質(zhì)的點狀不均勻分布變?yōu)椴糠趾藘?nèi)核仁區(qū)的明顯聚集，這種改變使得兩者能夠共定位于核仁。我們對pp5644和MafF的相互作用進行了深入研究。系列缺失實驗發(fā)現(xiàn)pp5644蛋白的第53位至96位氨基酸組成的Coiled—co訂do腿in與M

5、afF的第79至12I位氨基酸的亮氨酸拉鏈結構域是兩者發(fā)生相互作用的最小必要結構域。ONPG定量檢測實驗提示這兩個片斷之間的相互作用(pp5644△3和MafF△4)最強、最直接。對這兩個片斷的氨基酸序列分析和相互作用的計算機模擬，我們發(fā)現(xiàn)它們在氨基酸組成上非常相似，非典型的heptad—repeat中的d位點均為疏水氨基酸，都能夠在蛋白折疊時形成一條疏水帶。因此，在極性環(huán)境中，pp5644的這個區(qū)域能夠與MafF的bzIP結構以疏水界