熱脅迫下小菜蛾線粒體凋亡路徑基因和Hsp家族基因表達(dá)及對(duì)毒死蜱抗性進(jìn)化的影響.pdf

1、小菜蛾是十字花科植物的主要害蟲(chóng)，也是研究昆蟲(chóng)抗藥性的模式昆蟲(chóng)。本文通過(guò)研究抗性（抗毒死蜱品系）、敏感小菜蛾（幼蟲(chóng)、蛹以及成蟲(chóng)）在不同高溫條件下線粒體凋亡路徑基因和Hsp家族基因表達(dá)量的差異，從分子水平上揭示高溫條件下抗性與敏感小菜蛾之間的適合度關(guān)系以及高溫影響抗性小菜蛾種群ace1基因型頻率的原因。
　　凋亡體（Cytochrome c-Apaf-1-procaspase-9）在線粒體凋亡路徑中發(fā)揮重要作用。本文首次從小菜蛾中克隆

2、到組成凋亡體的3個(gè)蛋白基因，分別為cytochrome c，Apaf-1和caspase-9。其中，Apaf-1有兩個(gè)mRNA亞型，即Apaf-1a和Apaf-1b。小菜蛾cytochrome c（GenBank: KC507801）cDNA序列長(zhǎng)873 bp，含有一個(gè)327 bp的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼108個(gè)氨基酸，蛋白分子量為11.74 kDa，等電點(diǎn)為9.62。Apaf-1a（GenBank: KC588901） cDN

3、A序列長(zhǎng)5054 bp，含有一個(gè)4647 bp的完整ORF，編碼1548個(gè)氨基酸，蛋白分子量為175.96 kDa，等電點(diǎn)為6.85。Apaf-1b（GenBank: KF318722）cDNA序列長(zhǎng)4981 bp，含有一個(gè)4647 bp的完整ORF，編碼1548個(gè)氨基酸，蛋白分子量和等電點(diǎn)分別為175.96 kDa和6.85。Apaf-1a和Apaf-1b具有共同的ORF（4647 bp）和5’-非翻譯區(qū)（172 bp）序列，但Apa

4、f-1a在3’-非翻譯區(qū)比Apaf-1b長(zhǎng)73 bp。Apaf-1a和Apaf-1b的氨基酸序列同源性為100％。小菜蛾caspase-9（GenBank: KF365914）ORF序列長(zhǎng)1356 bp，編碼451個(gè)氨基酸，蛋白分子量為51.33 kDa，等電點(diǎn)為7.56。
　　本文從小菜蛾中克隆到3條hsp70 cDNA序列，分別為hsp72-1a，hsp72-1b和hsc70。其中，hsp72-1a和hsp72-1b屬于誘導(dǎo)型

5、hsp70，hsc70屬于組成型hsp70。hsp72-1a（GenBank: JQ693015.1）ORF序列長(zhǎng)1992 bp，編碼663個(gè)氨基酸，蛋白分子量為72.16 kDa，等電點(diǎn)為5.27。hsp72-1b（GenBank: JQ711194.1）ORF序列長(zhǎng)1992 bp，編碼663個(gè)氨基酸，蛋白分子量為72.13 kDa，等電點(diǎn)為5.34。hsc70（GenBank：JN676213.1）ORF序列長(zhǎng)1953 bp，編碼6

6、50個(gè)氨基酸，蛋白分子量為71.18 kDa，等電點(diǎn)為5.26。hsp72-1a，hsp72-1b和hsc70的氨基酸序列均含有Hsp70家族的三段高度保守序列以及ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)和核定位信號(hào)位點(diǎn)。
　　小菜蛾幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)經(jīng)37和42℃熱激誘導(dǎo)3 h后，線粒體凋亡路徑基因（cytochrome c，Apaf-1，caspase-9和caspase-7）mRNA表達(dá)量升高，而且總體上這些基因在抗性小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度高于在敏感

7、小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度。小菜蛾蛹經(jīng)38℃誘導(dǎo)48 h、40℃誘導(dǎo)8和16 h、42℃誘導(dǎo)4和8 h以及44℃誘導(dǎo)1 h后，上述4個(gè)線粒體凋亡路徑基因mRNA表達(dá)量均升高，而且 caspase-9和caspase-7在抗性小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度顯著高于在敏感小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度。高溫（33.5-50℃3 h）能夠誘導(dǎo)小菜蛾成蟲(chóng)Apaf-1，caspase-9和caspase-7基因上調(diào)表達(dá)，而且隨著處理溫度的升高，這3個(gè)基因的表達(dá)量均呈

8、現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最高值一般在42或47℃。高溫（40℃）能夠誘導(dǎo)小菜蛾成蟲(chóng)Apaf-1，caspase-9和caspase-7基因上調(diào)表達(dá)，在24、48和72 h處理中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這3個(gè)基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（caspase-7呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)）；另外，caspase-9和caspase-7在抗性小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度高于在敏感小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度。細(xì)胞凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高溫（40℃）能夠誘導(dǎo)抗性與敏感小菜

9、蛾發(fā)生細(xì)胞凋亡，而且抗性小菜蛾的凋亡程度高于敏感小菜蛾。
　　hsc70的基礎(chǔ)表達(dá)水平很高，但高溫不能顯著誘導(dǎo)hsc70基因上調(diào)表達(dá)。誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20的基礎(chǔ)表達(dá)水平很低，但經(jīng)高溫誘導(dǎo)后，這些基因的表達(dá)量顯著升高。小菜蛾幼蟲(chóng)、成蟲(chóng)經(jīng)高溫（37和42℃）誘導(dǎo)3 h后，誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20的表達(dá)量均顯著升高，而且42℃時(shí)的表達(dá)量顯著高于37℃時(shí)的表達(dá)量；另外，上述這些基因在敏感小菜蛾中的上

10、調(diào)表達(dá)幅度高于抗性小菜蛾。小菜蛾蛹經(jīng)38℃誘導(dǎo)48 h、40℃誘導(dǎo)8和16 h、42℃誘導(dǎo)4和8 h以及44℃誘導(dǎo)1 h后，誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20的表達(dá)量均顯著升高；在25℃條件下，上述這些基因在抗性小菜蛾中的表達(dá)量高于敏感小菜蛾，然而在熱激條件下，這些基因在敏感小菜蛾中的表達(dá)量卻高于抗性小菜蛾。高溫（33.5-50℃3 h）能夠誘導(dǎo)小菜蛾成蟲(chóng)誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20基因上調(diào)表達(dá)，而且隨著處理溫度的

11、升高，這些基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，最高值一般在42或47℃。高溫（40℃）能夠誘導(dǎo)小菜蛾成蟲(chóng)誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20基因上調(diào)表達(dá)，在24、48和72 h處理中，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，這些基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低或逐漸降低的趨勢(shì)?？偟膩?lái)說(shuō)，高溫能夠誘導(dǎo)誘導(dǎo)型hsp70s、hsp90和hsp20基因上調(diào)表達(dá)，而且這些基因在敏感小菜蛾中的上調(diào)表達(dá)幅度高于抗性小菜蛾。
　　在脫離殺蟲(chóng)劑選擇壓力下，隨著飼養(yǎng)