小菜蛾APN和Pxbre基因的克隆與mRNA表達(dá).pdf

1、小菜蛾（Plutellaxylostella L.）的生殖周期短、繁殖量大、適應(yīng)性廣，是世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，也是產(chǎn)生抗藥性最嚴(yán)重的害蟲之一。蘇云金桿菌Bacillusthuringiensis（Bt）內(nèi)毒素是一種殺蟲特異性高、對(duì)脊椎動(dòng)物安全的殺蟲蛋白，廣泛用于對(duì)小菜蛾的防治。由于其長期使用，已經(jīng)在部分地區(qū)發(fā)現(xiàn)了小菜蛾對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性。為了使這一環(huán)境友好型殺蟲劑能長期使用，有必要研究清楚其抗性機(jī)理。目前對(duì)小菜蛾抗性機(jī)理已經(jīng)在

2、生化和分子水平上做了一些基礎(chǔ)研究，但沒有明確的結(jié)論。本文對(duì)可能與抗性相關(guān)的小菜蛾4個(gè)Pxbre新基因進(jìn)行了克隆，并比較了APN，ALP及bre2-1ike等15個(gè)基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中的mRNA表達(dá)水平。
　　 1.小菜蛾9個(gè)APN基因和1個(gè)ALP基因mRNA表達(dá)水平的比較
　　 昆蟲中腸氨肽酶APN和堿性磷酸酯酶ALP表達(dá)量可能與Bt毒素抗性相關(guān)。本研究利用半定量PCR比較了9個(gè)氨肽酶APN基因和1個(gè)

3、堿性磷酸酯酶ALP基因在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系四齡幼蟲中腸間的mRNA相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)它們之間沒有顯著差異。推測(cè)小菜蛾對(duì)CrylAc毒素的抗性可能與這幾個(gè)基因的mRNA表達(dá)量無關(guān)。
　　 2.小菜蛾P(guān)xbre基因的克隆、序列分析和在小菜蛾CrylAc抗性和敏感品系中mRNA表達(dá)水平的比較
　　 在線蟲中，Bt毒素與中腸BBMV上糖脂受體結(jié)合后導(dǎo)致孔洞的形成、線蟲的死亡；在昆蟲中也有證據(jù)表明Bt毒素能與糖脂受體結(jié)

4、合。根據(jù)線蟲中4個(gè)bre基因及其同源基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，利用RT-PCR擴(kuò)增出小菜蛾中與線蟲bre基因同源的cDNA片段，再用RACE技術(shù)獲得了4個(gè)基因的全長cDNA，分別命名為Pxbre-1、Pxbre-3、Pxbre-4、Pxbre-5。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，這些基因和線蟲中相應(yīng)的基因序列具有較高的相似性，且具有相同的氨基酸保守模塊，推測(cè)所克隆的基因和對(duì)應(yīng)的線蟲bre基因有著類似的功能。
　　 比較小菜蛾CrylAc抗性

5、、敏感品系4個(gè)Pxbre基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品系間存在多個(gè)氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)，但是在抗性品系中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的氨基酸替換。在抗性品系中發(fā)現(xiàn)Pxbre-3基因的一個(gè)克隆中存在一個(gè)插入突變，經(jīng)過與基因組序列比對(duì)，表明該插入序列是由于該段中的內(nèi)含子未被剪切。該插入突變可以導(dǎo)致氨基酸翻譯被提前終止，但該突變是否與抗性有關(guān)需要進(jìn)一步研究。
　　 通過定量PCR技術(shù)檢測(cè)了5個(gè)Pxbre基因在小菜蛾四齡幼蟲、蛹、成蟲中的mRNA相對(duì)表達(dá)量