馬氏珠母貝外套膜不同區(qū)域差異礦化基因的克隆及功能研究.pdf

1、本文以馬氏珠母貝全基因組測(cè)序和外套膜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，從外套膜的邊緣膜(MO)區(qū)和中央膜(MC)區(qū)分別篩選出差異高表達(dá)的特異性功能基因，利用RACE技術(shù)克隆其序列全長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)候選基因進(jìn)行氨基酸序列分析和結(jié)構(gòu)特征性分析來(lái)確定是否具有礦化相關(guān)功能。然后通過(guò)熒光定量分析基因表達(dá)的組織差異，RNAi誘導(dǎo)基因沉默以探索其在貝殼礦化中的作用。結(jié)果如下:
　　1.篩選MC特異性表達(dá)基因:MC的主要功能是形成貝殼珍珠層。從馬氏珠母貝外套膜轉(zhuǎn)錄組

2、文庫(kù)中，篩選出MC顯著高表達(dá)的基因共有2298個(gè)，MC特異性表達(dá)的基因共228個(gè)，獲得NR注釋的基因197個(gè)。其中包括酪氨酸酶、鈣結(jié)合蛋白、金屬蛋白酶組織抑制劑TIMP、硫脂蛋白、MRNP等，還包括一些預(yù)測(cè)蛋白，如prestin-like、酪氨酸蛋白激酶、溶質(zhì)載體家族等。本研究對(duì)其中MC特異性表達(dá)的基因進(jìn)行序列特征性分析，同時(shí)由注釋信息得到并分析基因的功能結(jié)構(gòu)域，最終選出4個(gè)基因進(jìn)行深入研究，它們是幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、類(lèi)-α-2巨球蛋白、M

3、RNP(methionine-rich nacre protein)和未注釋基因5915。
　　2.采用RACE技術(shù)獲得幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因的cDNA序列，其全長(zhǎng)為2126bp，5' UTR為143bp，3'UTR為492bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?491bp，編碼496個(gè)氨基酸。由注釋信息及SMART預(yù)測(cè)出其具有Chitin-bind-3結(jié)構(gòu)域，說(shuō)明其能夠結(jié)合幾丁質(zhì)。熒光定量PCR結(jié)果顯示在馬氏珠母貝的珍珠囊、外套膜的套膜區(qū)(MP)和MC

4、中顯著高表達(dá)(p＜0.05)。RNAi結(jié)果顯示，注射幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白-dsRNA能夠顯著地抑制外套膜中幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白mRNA的表達(dá);同時(shí)導(dǎo)致貝殼內(nèi)表面的珍珠層結(jié)晶形態(tài)不完整，片層狀板塊細(xì)碎，晶體排列間隙大，局部有洞穴存在的現(xiàn)象，而正常的珍珠層晶體則是規(guī)則排列，各板塊晶體排列緊密且界限清晰，因此推斷幾丁質(zhì)和幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白是貝殼珍珠層有機(jī)質(zhì)不可或缺的組分。
　　3.類(lèi)-α-2巨球蛋白(α2M-like)基因cDNA序列全長(zhǎng)為3127bp

5、，5'UTR為390bp，3' UTR為322bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?415bp，編碼804個(gè)氨基酸。SMART預(yù)測(cè)其C端含有典型的α-2巨球蛋白較保守的三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)，即內(nèi)部硫酯區(qū)、受體結(jié)合區(qū)和誘餌區(qū)，以及98-GCGEQNM-304硫酯鍵結(jié)構(gòu)，故名。但是與典型的α-2巨球蛋白相比，α2M-likeN端部分缺失，該現(xiàn)象也出現(xiàn)在太平洋牡蠣貝殼蛋白中，表明α2M-like基因可能在雙殼類(lèi)動(dòng)物中具有不同的功能并可能與礦化作用相關(guān)。熒光定量結(jié)果顯示α

6、2M-like基因在外套膜中顯著高表達(dá)于其他組織(p＜0.05)。在RANi實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，注射α2M-like-dsRNA能夠顯著地抑制外套膜MC和MO的α2M-like mRNA表達(dá)水平，而在MP的表達(dá)量并沒(méi)有明顯下降。掃描電鏡結(jié)果顯示:α2M-like基因沉默，導(dǎo)致貝殼珍珠層和棱柱層超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，結(jié)晶體均形狀不規(guī)則，排列疏松，甚至有溶解消失的情況出現(xiàn)。因此，可初步確認(rèn)α2M-like參與了貝殼棱柱層和珍珠層的生物礦化過(guò)程

7、。
　　4.克隆獲得馬氏珠母貝的MRNP(methionine-rich nacre protein，Pm-MRNP)基因cDNA序列全長(zhǎng)為1226bp，5'UTR為99bp，3'UTR為446bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?81bp，編碼226個(gè)氨基酸。對(duì)Pm-MRNP氨基酸序列進(jìn)行特征性分析結(jié)果顯示，MRNP屬于堿性不溶性基質(zhì)蛋白，含8個(gè)保守的Cys殘基，形成4對(duì)潛在的二硫鍵，其序列富含MG-repeats結(jié)構(gòu)域。氨基酸多重序列比對(duì)結(jié)果發(fā)

8、現(xiàn)，Pm-MRNP與珠母貝和大珠母貝一致性高達(dá)85％，說(shuō)明MRNP在珍珠貝屬里序列高度保守。熒光定量結(jié)果表明，Pm-MRNP在馬氏珠母貝的珍珠囊、外套膜的MP和MC中顯著高表達(dá)(p＜0.05)。RANi實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射Pm-MRNP-dsRNA后，實(shí)驗(yàn)組外套膜的Pm-MRNP mRNA比對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(p＜0.05）;通過(guò)SEM掃描電鏡觀(guān)察貝殼內(nèi)表面的超微結(jié)構(gòu)，顯示實(shí)驗(yàn)組貝殼珍珠層表現(xiàn)出結(jié)晶形態(tài)不完整、不規(guī)則，板塊晶體顆粒

9、較小。因而證實(shí)Pm-MRNP在馬氏珠母貝中參與了貝殼珍珠層的形成。
　　5.未注釋功能基因82.8kDa蛋白基因cDNA全長(zhǎng)為3083bp，5'UTR為199bp，3' UTR為592bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?292bp，編碼763個(gè)氨基酸。NetOGlyc和kinasephos軟件預(yù)測(cè)其分別有65個(gè)糖基化位點(diǎn)和26個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可能經(jīng)過(guò)復(fù)雜的糖基化、磷酸化翻譯后修飾。此外，ProtParam預(yù)測(cè)為堿性不溶性分泌蛋白;IUPred網(wǎng)站預(yù)

10、測(cè)為特有Repeated low complexity domains(RLCDs)結(jié)構(gòu)的固有非序蛋白(IUPs orIDPs)。二級(jí)結(jié)構(gòu)則主要由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲組成。熒光定量結(jié)果顯示其在馬氏珠母貝的珍珠囊、外套膜的MP和MC中顯著高表達(dá)(p＜0.05)。RANi實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射82.8 kDa蛋白-dsRNA導(dǎo)致外套膜中mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著下降(p＜0.05);通過(guò)SEM檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組貝殼珍珠層表現(xiàn)出結(jié)晶形態(tài)不完整