hfad-3轉基因小鼠來源的胚胎干細胞生物學分析.pdf

1、多不飽和脂肪酸去飽和酶基因(fad-3）編碼的ω-3去飽和酶FAD3是定位于細胞內質網膜的一種膜整合蛋白，能夠將ω-6多不飽和脂肪酸(PUFAs)轉化為ω-3 PUFAs。本實驗室從亞麻(Linum usitatissimumL.)中克隆出fad-3基因，對其核苷酸序列進行人源化處理，得到優(yōu)化的fad-3基因，并記為hfad-3;通過顯微注射法，獲得了hfad-3轉基因小鼠。本研究從hfad-3轉基因小鼠的囊胚中分離出了5株轉基因小鼠胚

2、胎干細胞系，命名為Fad3-ESL1、2、3、4、5。通過免疫組化、qPCR和流式細胞分析等方法對所獲得的胚胎干細胞的生物學特性進行深入分析，揭示攜帶hfad-3的胚胎干細胞與非轉基因小鼠胚胎干細胞可能存在的生物學差異。
　　結果:(1) Fad3-ES在體外培養(yǎng)條件下，能夠長期保持未分化狀態(tài)，邊緣折光性好，呈典型的鳥巢狀干細胞形態(tài);堿性磷酸酶、SOX-2、OCT-4、NANOG和SSEA-1等干細胞標志性因子均呈陽性;在體外能夠

3、分化形成類胚體，體內可以形成具有內、中、外三胚層結構的畸胎瘤。(2)經檢測，外源基因hfad-3能夠穩(wěn)定整合于胚胎干細胞的基因組中，并且證實在傳代30代后，hfad-3仍然穩(wěn)定整合于細胞基因組中。而且，實時定量PCR數據顯示，hfad-3基因能夠在mRNA水平有效表達。(3)細胞生長曲線和倍增時間分析表明，Fad3-ES的細胞在接種后能夠快速增殖，72h后到達平臺期。與同代次的非轉基因對照細胞相比，細胞生長較慢。細胞周期的檢測結果也表明

4、，轉基因干細胞系的細胞周期比對照組相對滯后。(4)凋亡檢測的結果顯示，Fad3-ES的早期凋亡、凋亡和死亡細胞的比例都顯著低于對照組，而且不同代次之間，隨著代次增加，凋亡和死亡細胞比例升高，呈代次依賴規(guī)律，符合細胞的生長規(guī)律。(5)為了解干細胞中FAD3的功能情況，我們對不同代次的干細胞的脂肪酸表達做了分析，Fad3-ES細胞的ω-6/ω-3比率顯著低于對照組;細胞培養(yǎng)液中的脂肪酸分析結果與細胞的脂肪酸的結果具有一致性，多不飽和脂肪酸ω

5、-6/ω-3的比值都明顯降低。(6)在mRNA水平檢測與脂肪酸代謝相關的基因表達情況，LPL，FABP4，PPARγ，Pnpla2，Slc27a3，Cebpa的表達都發(fā)生了明顯變化。
　　綜上所述，分離自fad-3轉基因小鼠的ES細胞具有與非轉基因小鼠的胚胎干細胞相似的分離培養(yǎng)能力、干細胞特征、傳代能力和分化能力;更為重要的是，Fad-3-ES細胞具有比對照組更強的抗細胞凋亡能力。外源基因fad-3在不同代次的干細胞中穩(wěn)定表達，實