小鼠孤雄胚胎干細胞的建立和應用.pdf

1、孤雄胚胎由于缺少母源基因組而不能發(fā)育到期得到存活的動物，但是孤雄胚胎能夠在體外發(fā)育至囊胚并且建系得到孤雄胚胎干細胞。由于孤雄胚胎干細胞的印記基因的表觀遺傳狀態(tài)在體外培養(yǎng)過程中很難被改變，所以導致其產(chǎn)生嵌合體的能力較低。
　　 本研究借助“一步法”核移植技術(shù)高效地進行孤雄胚胎的重構(gòu)，并利用一種化學小分子-CBHA去處理孤雄胚胎，通過整個基因組的表觀遺傳修飾來改變孤雄胚胎的發(fā)育潛能及孤雄胚胎干細胞的多能性。與沒有經(jīng)過CBHA處理的對

2、照組相比，實驗組的孤雄胚胎在體外有較高的囊胚率，并且相應的孤雄胚胎干細胞也能夠通過囊胚注射的方法獲得健康的嵌合體動物。通過亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn)，CBHA處理過后得到的孤雄胚胎干細胞的H19的差異甲基化區(qū)域(DMR)的甲基化狀態(tài)得到了改變。同時，real-time PCR實驗分析發(fā)現(xiàn)這些孤雄胚胎干細胞中的印記基因H19、Dio3和U2af1-rs1的基因表達量已趨近于受精卵來源的胚胎干細胞的表達量。CBHA所帶來的這些分子生物學變化有可能與

3、孤雄胚胎干細胞多能性改善有關(guān)，這也為我們提供了一種改變孤雄胚胎干細胞多能性的新方法，同時也對于我們更好的理解表觀遺傳調(diào)控提供了新的研究思路。
　　 孤雄單倍體胚胎可以通過“一步法”核移植技術(shù)將精子注射入去核卵母細胞中得到，這些胚胎可以建立得到孤雄單倍體胚胎干細胞系。孤雄單倍體胚胎干細胞具有典型的胚胎干細胞的集落，表達多能性標記物，能夠形成畸胎瘤和嵌合體，同時還具有生殖系嵌合的能力，是一類新型的具有多能性的胚胎干細胞。通過對孤雄單

4、倍體胚胎干細胞構(gòu)建的嵌合體胚胎進行DNA含量分析發(fā)現(xiàn)，在嵌合體胚胎發(fā)育第6.5(E6.5)天時仍然可以檢測到單倍體的存在，所以，本研究通過將孤雄單倍體胚胎干細胞進行體外分化，獲得了上胚層樣的單倍體胚胎干細胞(Haploid EpiSC-like cells)系。隨后，將這些上胚層樣的單倍體胚胎干細胞進行神經(jīng)分化，能夠迅速地得到神經(jīng)干細胞，并且這些神經(jīng)干細胞中也有一定比例的單倍體細胞存在。
　　 本研究在卵母細胞胞漿內(nèi)注射孤雄單倍