豬流行性腹瀉病毒ORF3蛋白亞細胞定位信號的研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的急性接觸性腸道傳染病，主要癥狀為嘔吐、腹瀉和脫水。不同年齡的豬都易感染，哺乳仔豬最為嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。ORF3是目前PEDV基因組發(fā)現(xiàn)的唯一的附屬基因，ORF3編碼ORF3蛋白，ORF3蛋白與病毒毒力有關，因此對PEDV ORF3蛋白開展亞細胞定位

2、信號的研究，有助于了解該蛋白在細胞內的轉運及其毒力作用機制。
　　本實驗的研究內容和結論如下：
　　⑴實驗前期，將DR13 ORF3蛋白克隆至真核表達載體pEGFP-C1中，構建重組質粒pEGFP-PEDV-ORF3，并將它和空載體pEGFP-C1分別轉染Vero細胞。16 h后激光共聚焦顯微鏡（LCM）觀察分析，在pEGFP-PEDV-ORF3轉染的細胞中，融合蛋白定位在細胞質中，而在pEGFP-C1轉染的細胞中，EGFP

3、分布在細胞質和細胞核中。這表明附加的ORF3蛋白本身或者附加的ORF3蛋白中存在某個結構使其定位在細胞質上。
　　⑵為了驗證ORF3蛋白中是否存在這種結構，我們結合DR13att ORF3的氨基酸序列和CV777wt ORF3預測跨膜域（TM1:40-63aa、TM2:75-91aa、TM3:116-139aa、TM4:150-173aa）對ORF3蛋白進行了截短分區(qū)。第一部分是包含四個預測跨膜域的ORF3（1-173aa），第二

4、部分是非預測跨膜域ORF3（174-225aa），構建重組質粒后分別轉染Vero細胞。16 h后LCM分析，在pEGFP-PEDV-ORF3（1-173aa）轉染的細胞中，融合蛋白定位在細胞質中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（174-225aa）轉染的細胞中，融合蛋白分布在細胞質和細胞核中。說明ORF3（1-173aa）中存在某種結構使融合蛋白不進細胞核。
　?、菫檎页鯫RF3（1-173aa）中使融合蛋白不進細胞核表達的結

5、構，我們將ORF3（1-173aa）截短為兩部分，第一部分是ORF3（1-91aa），該部分主要包含TM1和TM2，第二部分是ORF3（92-173aa），該部分包含TM3和TM4，構建重組質粒并分別轉染Vero細胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在pEGFP-PEDV-ORF3（1-91aa）轉染
　　的細胞中，融合蛋白定位在細胞質中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（92-173aa）轉染的細胞中，融合蛋白分布在細胞質和細胞核中，

6、表明ORF3（1-91aa）是使融合蛋白不進細胞核的關鍵結構。
　?、葹檫M一步分析ORF3（1-91aa）中是否存在使融合蛋白不進細胞核的關鍵結構，ORF3（1-91aa）被分為兩部分，第一部分為ORF3（1-39aa），該部分不包含預測跨膜域，第二部分為ORF3（40-91aa），該部分包含TM1和TM2，構建重組質粒并分別轉染Vero細胞。16 h后LCM觀察發(fā)現(xiàn)在pEGFP-PEDV-ORF3（1-39aa）轉染的細胞中，融

7、合蛋白分布在細胞質和細胞核中，而在pEGFP-PEDV-ORF3（40-91aa）轉染的細胞中，融合蛋白定位在細胞質中。
　　為驗證ORF3（40-91aa）是否是阻止融合蛋白進入細胞核的關鍵結構，我們將整段ORF3序列中的40-91aa敲除，并將剩下的片段克隆至表達載體pEGFP-C1中，構建重組質粒pEGFP-PEDV-ORF3（1-39+92-225aa）并轉染至Vero細胞。16 h后LCM分析發(fā)現(xiàn)融合蛋白分布在細胞質和細

8、胞核中。這個結果表明，ORF3蛋白中除攜帶有第40位-91位肽的片段外，其余剩下的片段都能進入細胞核，所以我們判斷ORF3（40-91aa）是使融合蛋白定位在細胞質的重要結構域。
　?、?ORF3（40-91aa）中某一部分可能是阻止融合蛋白進入細胞核的重要結構域，因此對ORF3（40-91aa）進行再次截短。ORF3（40-91aa）被分成三部分，第一部分為 ORF3（40-63aa），主要包含 TM1；第二部分為ORF3（64

9、-74aa），該部分是位于TM1和TM2之間的非預測跨膜域；第三部分為O RF3（75-91aa），該部分包含 TM2，構建重組質粒pEGFP-PEDV-ORF3（40-63aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（64-74aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（75-91aa）后分別轉染Vero細胞。16 h后LCM觀察結果，在這三個重組質粒轉染的Ve ro細胞中，融合蛋白定位在細胞質和細胞核中。表明ORF3（40-91aa）中這三個

10、單獨的氨基酸區(qū)段ORF3（40-63aa）、ORF3（64-74aa）、ORF3（75-91aa）都不能阻止融合蛋白進入細胞核。
　?、饰覀冏C實了TM1，TM2和它們之間的連接多肽都不能阻止融合蛋白進入細胞核，那么這三個部分中的任意兩部分會不會同時起作用呢？基于此，我們構建相應的重組質粒pEGFP-PEDV-ORF3（40-74aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（64-91aa）、pEGFP-PEDV-ORF3（40-63+7