四川豬流行性腹瀉病毒流行株S基因的分子特征與S蛋白抗原性的初步分析.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染疾病。自2010年以來，PEDV感染已成為全球養(yǎng)豬業(yè)共同關(guān)注的問題。及時(shí)掌握PEDV流行毒株的分子特征，對(duì)指導(dǎo)該病具有重要意義。
　　S基因編碼的S蛋白是PEDV的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護(hù)等方面起關(guān)鍵作用，S基

2、因較易發(fā)生變異。本研究對(duì)四川2014年P(guān)EDV流行毒株的S基因（包括S基因全序列和部分序列）進(jìn)行克隆、測(cè)序和分子特性分析，初步分析了流行株的S基因抗原性（包含COE區(qū)的抗原區(qū)域）。研究內(nèi)容如下:
　　(1)四川PEDV流行株S基因的克隆與分子特征分析:以RT-PCR檢測(cè)了四川14個(gè)地區(qū)的17個(gè)豬場(chǎng)的102份發(fā)病仔豬腹瀉樣本，豬場(chǎng)PEDV陽性率達(dá)到100％(17/17)，樣品PEDV陽性率為88.2％(99/102)。PEDV多為單

3、獨(dú)感染。根據(jù)PEDV-CV777株序列（GenBank登錄號(hào):AF353511）設(shè)計(jì)3對(duì)引物擴(kuò)增完整的S基因，選取2014年四川地區(qū)PEDV代表樣品擴(kuò)增了9株S基因全序列和18株S1區(qū)（起止位點(diǎn):1-1389nt），采用RT-PCR擴(kuò)增S基因、克隆、測(cè)序和序列分析。
　　結(jié)果表明:S基因S1片段變異較大，18株流行株S1片段全長為1398bp，編碼466個(gè)氨基酸，存在大量核苷酸的突變、插入及缺失，多以C→T、T→C、G→T、T→G

4、等突變形式存在。9株完整S基因中，8株全長為4161bp，編碼1386個(gè)氨基酸，1株為4125bp，編碼1374個(gè)氨基酸。PEDV四川流行株之間核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均較高，與SC-L株及CV777疫苗株等的同源性均較低，與2013-2014年US株、Thailand、2014年韓國株等的同源性較高。
　　S基因編碼的多肽鏈具有較好的親水性，分別含有1個(gè)跨膜區(qū)域及信號(hào)肽切割位點(diǎn)，潛在的磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)與CV777

5、差異較大。密碼子偏嗜性分析表明S基因?qū)幋a的T'rp，Met，His，Asp，Cys氨基酸具有一定的偏嗜性。S蛋白含有多個(gè)α螺旋區(qū)段、β折疊區(qū)段、β轉(zhuǎn)角區(qū)域及無規(guī)則卷曲區(qū)域。
　　遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，本研究中的PEDV四川地區(qū)流行毒株均屬于同一群，18株四川流行株S1區(qū)與中國株CH8、YS、CHGD-01、GDMZ/2013、韓國株 CNU-091222-01、美國株 USA/Iowa/18984/2013、 USA IA2、U

6、SA/Indiana/17846/2013、USA/Kansas125/2014、USA/Texas128/2014、最新韓國株Korea KUIDL-PED-2014-002及KUIDL-PED-2014-007、泰國株ThailandPPED0108、Thailand1-55ST0412、Thailand6-56ST0413、Thailand SBPED0211-2等親緣關(guān)系較近。COE區(qū)與S全基因與參考株的親緣關(guān)系與S1區(qū)相似，但

7、COE區(qū)具有地區(qū)性差異，這提示四川境內(nèi)流行的毒株也在不斷進(jìn)化。此外，研究中所有四川地區(qū)PEDV流行毒株均與經(jīng)典毒株CV777、Brl/87，中國早期流行毒株LZC、SC-L、DX、韓國株Chinju99、DR13及日本株83p-5等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　(2)S蛋白抗原性的初步分析:本研究設(shè)計(jì)了包含COE區(qū)的部分S蛋白片段（命名為SD蛋白）的特異性引物SD-F、SD-R，用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了PEDV四川樂山流行株及CV777疫苗

8、株的892bp的抗原表位片段，并插入原核表達(dá)載體 pET39b(+)中，分別構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET39b-SC-SD及pET39b-Vaccine-SD。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，經(jīng)37℃，1mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h，SDS-PAGE顯示目的基因片段得到表達(dá)，目的蛋白分子量約為62kD，表達(dá)量較低。將包涵體切膠純化，以獲得的S蛋白抗原免疫家兔獲得兔抗多克隆抗體，通過瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗體效價(jià)，流行株及疫苗