副豬嗜血桿菌重要免疫原性相關(guān)蛋白發(fā)掘及GAPDH免疫調(diào)節(jié)機理研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎，關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，已成為引起豬細(xì)菌性疾病最重要病原之一。仔豬感染副豬嗜血桿菌之后幾天就可以發(fā)病，并經(jīng)常引起死亡。從急性期發(fā)病康復(fù)的仔豬經(jīng)常會出現(xiàn)慢性關(guān)節(jié)炎癥狀?？股刂委煾必i嗜血桿菌有一定效果。但長期使用一方面導(dǎo)致細(xì)菌耐藥情況嚴(yán)重，另一方面抗生素的濫用導(dǎo)致藥物在動物食品的藥物殘留。因此，疫苗仍然是控制該病原菌最佳的手段。到目前為止，副豬嗜血桿菌共鑒定出15種血清型，每種血清型菌株的毒力又有差異。此外，

2、還有很多菌株沒有被定型。各種血清型之間的交叉免疫保護(hù)十分有限。當(dāng)前使用的商業(yè)化滅活疫苗能夠?qū)ν囱逍途旮腥咎峁┮欢ǖ拿庖弑Ｗo(hù)，但不能提供異源血清型菌株感染的交叉保護(hù)。因此，急需研制開發(fā)出一種能夠提供持久免疫保護(hù)和針對多種血清型菌株感染具有交叉免疫保護(hù)的新型疫苗。目前，關(guān)于副豬嗜血桿菌毒力相關(guān)因子很少被報道。外膜蛋白是細(xì)菌的表面重要組成部分，能夠和宿主細(xì)胞發(fā)生互作，并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性抗體和引起細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此針對靶向外膜蛋白發(fā)展疫

3、苗非常有價值。本課題在實驗室前期完成的副豬嗜血桿菌流行優(yōu)勢血清5型SH0165菌株全基因組序列基礎(chǔ)上，基于生物信息學(xué)及SignalP2.0軟件，預(yù)測了副豬嗜血桿菌可能的重要外膜蛋白。進(jìn)一步將編碼外膜蛋白基因克隆、表達(dá)純化后利用動物感染模型進(jìn)行了蛋白免疫原性研究。同時，開展了外膜蛋白的免疫生物學(xué)活性研究，并從中篩選到了一個能夠促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞增值的蛋白3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，可能是一個重要免疫調(diào)節(jié)蛋白，深入探討了該免疫調(diào)節(jié)蛋

4、白免疫調(diào)節(jié)的機理。構(gòu)建了編碼GAPDH蛋白的DNA疫苗，并開展了相關(guān)免疫原性及免疫保護(hù)研究。主要的研究內(nèi)容包括如下：
　　 ⑴副豬嗜血桿菌SH0165菌株可能外膜蛋白預(yù)測、蛋白免疫原性和保護(hù)效力研究。首先利用SignalP2.0軟件，通過同源相似性比對預(yù)測了cdtB，GAPDH，HPS-2037, OmpP1, HPS-0220, HPS-0675,HPS-1406, HPS-1834, OapA, IdgA等10個可能的外膜蛋

5、白，克隆表達(dá)并純化了10個外膜蛋白。將10種重組外膜蛋白免疫小鼠后28天進(jìn)行了5×LD50劑量的攻擊。結(jié)果表明，rGAPDH，rOapA和rHPS-0675三種重組蛋白具有很好的免疫保護(hù)效果，分別為75％，87.5％和75％。進(jìn)一步將這三種蛋白單獨或混合形式以豬為感染模型進(jìn)行了免疫反應(yīng)和保護(hù)效力研究。結(jié)果表明，三種蛋白都能夠引起很好的體液免疫反應(yīng)并分別提供70％，50％和70％的免疫保護(hù)，而混合蛋白免疫提供的免疫保護(hù)力最高，為80％。而

6、3種蛋白產(chǎn)生的抗體和混合蛋白的抗體在全血殺菌試驗中都能夠抑制細(xì)菌的生長。研究結(jié)果進(jìn)一步提示rGAPDH, rOapA和rHPS-0675重組蛋白能夠介導(dǎo)針對副豬嗜血桿菌SH0165菌株感染的免疫保護(hù)，是重要的疫苗候選抗原，能夠研制開發(fā)成一種多組分通用型亞單位疫苗。
　　 ⑵副豬嗜血桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力研究。研究結(jié)果表明編碼3-磷酸甘油醛脫氫酶的gapA基因廣泛存在于15種標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株中而且基因序列

7、比較保守，前期研究也顯示其是一種很好的疫苗候選抗原。因此我們進(jìn)一步構(gòu)建了GAPDH蛋白的DNA疫苗pCgap，并在小鼠感染模型中評價了該DNA疫苗免疫反應(yīng)和針對血清4型菌株MD0322和血清5型菌株SH0165的攻擊所提供的免疫效力。結(jié)果表明，DNA疫苗通過肌內(nèi)免疫小鼠之后能夠產(chǎn)生顯著的抗體反應(yīng)。而且產(chǎn)生的抗體具有殺菌作用。DNA疫苗免疫小鼠7天之后能夠在肌肉、肝臟、脾臟和腎臟中檢測到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。IgG亞類分析表明DNA疫苗可以同時誘導(dǎo)T

8、h1和Th2型免疫反應(yīng)，但是IgG1型免疫反應(yīng)強于IgG2a型免疫反應(yīng)。此外，DNA疫苗能夠提供分別針對血清4型菌株MD0322攻擊的保護(hù)率83.3％和血清5型菌株SH0165攻擊的保護(hù)率50％。免疫組免疫保護(hù)力顯著高于陰性對照組和空白對照組。以上結(jié)果提示DNA疫苗pCgap為控制副豬嗜血桿菌的感染提供一個新的策略。
　　 ⑶副豬嗜血桿菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)免疫調(diào)節(jié)機理研究。研究表明，一些外膜蛋白通過修改宿主的免疫

9、系統(tǒng)來影響細(xì)菌在體內(nèi)定植能力并且可以刺激宿主產(chǎn)生IL-2或者IL-10的能力。因此，本研究探討副豬嗜血桿菌外膜蛋白是否在參與調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)方面起著重要作用。通過將12種外膜蛋白(cdtB, GAPDH, HPS-2037, OmpP1, HPS-0220, HPS-0675, HPS-1406, HPS-1834,OapA，6PGD，HPS-1889，IdgA)體外刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞，從中篩選到了外膜蛋白GAPDH能夠顯著上調(diào)脾臟細(xì)

10、胞表面CD69分子的表達(dá)。通過MTT實驗結(jié)果也表明GAPDH蛋白能夠促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞的增值和B細(xì)胞的分化。進(jìn)一步構(gòu)建了GAPDH過表達(dá)菌株GAO，開展了過表達(dá)菌株小鼠體內(nèi)定植、誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞因子、中性粒細(xì)胞所介導(dǎo)的殺傷和對宿主免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響等實驗。結(jié)果表明:GAPDH能夠促進(jìn)機體對副豬嗜血桿菌的清除和誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IL-2。與野生菌株相比，過表達(dá)菌株GAO更容易被中性粒細(xì)胞和小鼠的巨噬細(xì)胞所殺傷。而且，機體感染過表達(dá)菌株GAO之