副豬嗜血桿菌凍干保護劑及ompA蛋白表達(dá)、純化及免疫原性的研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌（HaemopHilus parasuis，HPS）是引起豬Glasser氏病的病原體，在臨床上以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病以成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。
　　 利用基因敲除策略構(gòu)建HPS弱毒疫苗是當(dāng)前HPS研究的熱點。但HPS對外界抵抗力不強，4℃僅可存活7～10日，在凍干過程易死亡，菌體死亡后免疫豬體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，影響弱毒疫苗的應(yīng)用。為提高HPS存活率，本

2、研究研制了HPS凍干保護劑，為HPS弱毒疫苗研發(fā)提供技術(shù)儲備。
　　 HPS外膜蛋白ompA的單克隆抗體在體內(nèi)（小鼠）和體外都表現(xiàn)出中和保護活性，證明ompA可作為亞單位疫苗，因而表達(dá)ompA并研究其免疫原性。本研究從兩個方向展開:
　　 1.副豬嗜血桿菌凍干保護劑研制
　　 為凍干HPS，首先篩選出BHI為適宜HPS生長的培養(yǎng)基，并凍干副豬嗜血桿菌15種血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株雞胚卵黃菌液，作為工作種子批。
　　

3、 為篩選HPS凍干保護劑配方，采用凍存實驗篩選高存活率配方，測定配方共晶點，設(shè)計凍干曲線，測定其凍干存活率為20～30％。利用單組分缺失實驗分析各組分的重要性并調(diào)整組分比例。為提高保護劑存活率，研究了保護劑基質(zhì)如海藻糖、氨基酸、PH值、緩沖系統(tǒng)和BHI培養(yǎng)基等對HPS凍干存活率的影響，結(jié)果證明:保護劑中添加1％海藻糖，凍干存活率提高至56.68％;添加3％L-精氨酸鹽酸鹽存活率提高至65％～70％;保護劑與BHI培養(yǎng)基按照2∶1配比，副

4、豬嗜血桿菌凍干存活率可達(dá)73.69％～80％。
　　 為確定影響存活率的顯著因子及其最佳水平，采用Plackett-Burman實驗和Box-Behnken響應(yīng)面實驗優(yōu)化保護劑配方，結(jié)果證明D-海藻糖、D-山梨醇和L-精氨酸鹽酸鹽為影響存活率的顯著因素。
　　 2.副豬嗜血桿菌外膜蛋白ompA克隆表達(dá)
　　 設(shè)計引物擴增副豬嗜血桿菌外膜蛋白ompA基因，連接原核表達(dá)載體pET-32a，成功構(gòu)建了ompA基因原核表