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文檔簡介
1、副豬嗜血桿菌(HaemopHilus parasuis,HPS)是引起豬Glasser氏病的病原體,在臨床上以多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為主要特征。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,該病以成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。
利用基因敲除策略構(gòu)建HPS弱毒疫苗是當(dāng)前HPS研究的熱點(diǎn)。但HPS對外界抵抗力不強(qiáng),4℃僅可存活7~10日,在凍干過程易死亡,菌體死亡后免疫豬體產(chǎn)生過敏反應(yīng),影響弱毒疫苗的應(yīng)用。為提高HPS存活率,本
2、研究研制了HPS凍干保護(hù)劑,為HPS弱毒疫苗研發(fā)提供技術(shù)儲備。
HPS外膜蛋白o(hù)mpA的單克隆抗體在體內(nèi)(小鼠)和體外都表現(xiàn)出中和保護(hù)活性,證明ompA可作為亞單位疫苗,因而表達(dá)ompA并研究其免疫原性。本研究從兩個(gè)方向展開:
1.副豬嗜血桿菌凍干保護(hù)劑研制
為凍干HPS,首先篩選出BHI為適宜HPS生長的培養(yǎng)基,并凍干副豬嗜血桿菌15種血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株雞胚卵黃菌液,作為工作種子批。
3、 為篩選HPS凍干保護(hù)劑配方,采用凍存實(shí)驗(yàn)篩選高存活率配方,測定配方共晶點(diǎn),設(shè)計(jì)凍干曲線,測定其凍干存活率為20~30%。利用單組分缺失實(shí)驗(yàn)分析各組分的重要性并調(diào)整組分比例。為提高保護(hù)劑存活率,研究了保護(hù)劑基質(zhì)如海藻糖、氨基酸、PH值、緩沖系統(tǒng)和BHI培養(yǎng)基等對HPS凍干存活率的影響,結(jié)果證明:保護(hù)劑中添加1%海藻糖,凍干存活率提高至56.68%;添加3%L-精氨酸鹽酸鹽存活率提高至65%~70%;保護(hù)劑與BHI培養(yǎng)基按照2∶1配比,副
4、豬嗜血桿菌凍干存活率可達(dá)73.69%~80%。
為確定影響存活率的顯著因子及其最佳水平,采用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化保護(hù)劑配方,結(jié)果證明D-海藻糖、D-山梨醇和L-精氨酸鹽酸鹽為影響存活率的顯著因素。
2.副豬嗜血桿菌外膜蛋白o(hù)mpA克隆表達(dá)
設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增副豬嗜血桿菌外膜蛋白o(hù)mpA基因,連接原核表達(dá)載體pET-32a,成功構(gòu)建了ompA基因原核表
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