擬穴青蟹SpToll基因的克隆、表達(dá)及其SNPs研究.pdf

1、Toll受體是一種重要的模式識(shí)別受體,在天然免疫過(guò)程中起著識(shí)別病原物并觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的作用,被視為天然免疫向特異性免疫過(guò)渡的橋梁。目前人們已在果蠅中發(fā)現(xiàn)9種Toll樣受體,在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)13種Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)。然而迄今為止,擬穴青蟹是否具有TLRs,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。為此,本研究采用分子生物學(xué)、免疫學(xué)的方法,對(duì)擬穴青蟹中的Toll樣受體(SpToll)及其性質(zhì)進(jìn)行了深入的研究,所獲

2、研究結(jié)果具體如下:
　　1、SpToll基因克隆及生物信息學(xué)分析
　　采用簡(jiǎn)并PCR結(jié)合RACE技術(shù),首次在擬穴青蟹體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并克隆得到Toll樣受體同源基因SpTollcDNA全序列,其cDNA全長(zhǎng)3843bp,開(kāi)放讀碼框?yàn)?018bp,編碼1006個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)該多肽具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,是一種跨膜蛋白。經(jīng)BLAST比對(duì),SpToll基因與多種節(jié)肢動(dòng)物Toll受體蛋白高度同源,與日本對(duì)蝦MjToll、凡納濱對(duì)蝦LvTol

3、l和果蠅DmToll的序列相似性分別達(dá)到43％、39%和32%。SpToll具有典型的Toll樣受體結(jié)構(gòu):包括胞外富亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域(leucine-rich repeats,LRRs),跨膜區(qū)和胞內(nèi)TIR結(jié)構(gòu)域(Toll/IL-1 receptor homologous region),糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),SpToll胞外區(qū)有14個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)。該研究結(jié)果證實(shí)了擬穴青蟹中Toll樣受體的存在,為深入了解青蟹免疫機(jī)制奠定了良好

4、的基礎(chǔ)。
　　2、SpToll mRNA組織特異性表達(dá)及病原相關(guān)分子模式研究
　　RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)SpToll基因在心、鰓、肝、胃、腸、肌肉、眼柄和血細(xì)胞中廣泛表達(dá),未發(fā)現(xiàn)明顯的組織表達(dá)特異性。Real-time PCR研究顯示,青蟹血細(xì)胞SpToll基因mRNA表達(dá)豐度在注射副溶血弧菌3h后顯著下調(diào),然后逐漸上升,至48h上調(diào)極顯著,達(dá)到0h表達(dá)量的2.5倍;LPS注射3h后,該基因表達(dá)豐度相對(duì)于對(duì)照組下調(diào)極顯著,至4

5、8h仍處于下調(diào)顯著水平;而PolyI:C注射組青蟹血細(xì)胞SpToll基因表達(dá)豐度與對(duì)照組相比差異不顯著。這預(yù)示著青蟹SpToll基因可能參與抵抗細(xì)菌類(lèi)病原物入侵的免疫應(yīng)答。
　　3、SpToll LRRs區(qū)SNPs(single nucleotide polymorphisms)多態(tài)性及病原識(shí)別相關(guān)性分析
　　為了進(jìn)一步探索SpToll識(shí)別病原微生物的分子基礎(chǔ),我們選取SpToll病原相關(guān)分子模式識(shí)別區(qū)LRRs,采用PCR-

6、DGGE技術(shù)、構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)結(jié)合目的基因重測(cè)序技術(shù),進(jìn)一步對(duì)其SNPs多態(tài)性及病原識(shí)別相關(guān)性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在SpToll基因LRRs區(qū)存在到大量的SNPs位點(diǎn),平均每個(gè)個(gè)體DNA水平為55個(gè),cDNA水平為61個(gè),多數(shù)位點(diǎn)豐度較低,突變頻率約為1%～4%。有意思的是,我們同時(shí)在SpToll基因胞外區(qū)LRR13的插入序列(438-451)發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變率達(dá)50%以上的高頻突變位點(diǎn)1847,其cDNA序列由A突變?yōu)镚(c.1847A>G

7、),所編碼氨基酸由賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝彼?突變類(lèi)型為錯(cuò)義突變。經(jīng)生物信息學(xué)分析,該突變可導(dǎo)致SpToll二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,提示該位點(diǎn)可能與SpToll特異性識(shí)別病原微生物有關(guān)。
　　在此基礎(chǔ)之上,進(jìn)一步采用PCR產(chǎn)物測(cè)序技術(shù)對(duì)c.1847A>G位點(diǎn)不同基因型在群體中的分布規(guī)律進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),3種基因型在群體中比例相差較大,野生型(A/A)占55%,雜合型(A/G)占33%,突變型(G/G)占12%。等位基因c.1847A的頻率為

8、0.7143,c.1847G的頻率為0.2857,X2檢驗(yàn)結(jié)果顯示該位點(diǎn)屬于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。其群體雜合度為0.5918,PIC為0.3249,表明該基因座位屬于中度多態(tài),提示擬穴青蟹群體內(nèi)遺傳變異較大,該位點(diǎn)(c.1847A>G)有望作為一種新的分子標(biāo)記用于抗逆優(yōu)良青蟹的篩選。
　　綜上所述,本研究主要發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹中存在Toll受體同源基因SpToll,其可能主要參與識(shí)別、抵抗細(xì)菌類(lèi)病原物入侵的免疫應(yīng)答。所獲