擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)及抗氧化相關(guān)基因的研究分析.pdf

1、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是我國沿海最為常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量都很大，是我國重要的三大經(jīng)濟蟹類之一，具有很高的經(jīng)濟價值、藥用價值和營養(yǎng)價值，因而具有很高的研究價值。
　　本文通過構(gòu)建文庫和RACE克隆等方法獲得了擬穴青蟹硫氧還蛋白-1基因cDNA序列，并運用實時熒光定量PCR技術(shù)分析其在不同組織和副溶血弧菌感染條件下的表達情況；此外，對硫氧還蛋白還原酶在不同組織和細菌感染條件下的活性變化進行了

2、分析；最后，運用GeXP多重基因表達技術(shù)對擬穴青蟹抗氧化系統(tǒng)中的部分基因進行了初步探究。主要研究結(jié)果如下：
　　1.硫氧還蛋白(Thioredoxin, Trx)屬于氧化還原蛋白家族。本文運用SMART技術(shù)獲得了擬穴青蟹Trx1基因的cDNA全長，系統(tǒng)進化分析顯示它與其他物種Trx基因具有較高的同源性，綜合分析后確定命名為擬穴青蟹硫氧還蛋白-1基因（SpTrx1）。SpTrx1的cDNA全長672 bp，包括318 bp的開放閱讀

3、框（ORF)，編碼105個氨基酸，分子量約為12.05 kDa，等電點約為4.85。運用熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR)技術(shù)檢測SpTrx1在擬穴青蟹不同組織（肝胰腺、血液、心臟、肌肉、精巢、鰓）中的表達差異，結(jié)果顯示SpTrx1在6個組織中均有表達，其中鰓和精巢中最高，血液中最低。SpTrx1組織表達的普遍性說明它參與了擬穴青蟹的基礎(chǔ)代謝。副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus

4、）感染實驗結(jié)果顯示：血液中的SpTrx1在感染后不同時間節(jié)點的表達量變化差異顯著(P<0.05)，在前12 h之間變化不明顯，至12 h時突然下降，18 h小時開始逐漸上升，在48 h顯著升高，72 h達到最高值，隨后緩緩下降，96 h恢復(fù)正常水平。表明SpTrx1在血液中的作用緩慢而持續(xù)，推測該基因可能與機體防御和抵抗外來入侵病源菌密切相關(guān)，參與擬穴青蟹的抗病過程。
　　2.硫氧還蛋白還原酶(Thioredoxin Reduct

5、ase,TrxR)是一種二聚體硒酶，屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族，催化依賴硫氧還蛋白NADPH的還原反應(yīng)。本文根據(jù)DTNB還原法原理，運用比色方法檢測擬穴青蟹不同組織（肝胰腺、血液、心臟、肌肉、鰓）以及弧菌感染后不同時間節(jié)點不同組織（血液、鰓、肝胰腺、心臟）中TrxR的活性變化情況。結(jié)果顯示，TrxR的活性在鰓和心臟中較高，其次是血液，肝胰腺和肌肉?；【碳嶒灲Y(jié)果表明，在副溶血弧菌刺激后，TrxR的活性在血液、鰓、肝胰腺和心

6、臟組織中具有大致相同的變化趨勢：在2-6h活性較低，8 h-24 h活性最高，48h之后開始緩慢降低，直至72 h恢復(fù)正常水平。表明TrxR可能參與擬穴青蟹機體的抗氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。
　　3.抗氧化系統(tǒng)可以清除體內(nèi)過多的氧自由基、保護細胞免受氧化損傷，維持機體內(nèi)氧環(huán)境平衡，抵抗外界環(huán)境影響。本文運用GeXP多重表達技術(shù)研究擬穴青蟹中與抗氧化相關(guān)的8個基因在不同組織以及弧菌感染后不同時間節(jié)點血液中的表達情況，結(jié)果顯示，Cu/ZnS

7、OD和CAT在肝胰腺和血液中表達量較高，Trx1在鰓和血液中表達量較高，MnSOD在血液、肝胰腺、心臟和精巢中的表達量較高，PRX在血液和鰓中表達量比較高，Trx2和GSTs在鰓和肝胰腺中表達量高，GPX在心臟和鰓中表達量最高。它們在肌肉和精巢中表達均很低。該結(jié)果顯示血液、肝胰腺和鰓可能是擬穴青蟹免疫反應(yīng)的主要組織和器官，可能在抗氧化和免疫防御中具有重要作用。在弧菌感染后表達量差異顯著(P<0.05)，這8個基因的變化趨勢幾乎一致，在感

8、染的前4h變化不明顯，4h的表達量基本很低，6h突然上升，處于最高水平，8 h小時迅速恢復(fù)平穩(wěn)，在12 h顯著升高，24h-96h下降直到恢復(fù)正常。GSTs、PRX，Trx1在6 h表達量均較高；Cu/ZnSOD和Trx2在6 h和12 h表達量顯著升高；GPX和MnSOD在8 h表達量較高，CAT在6 h和12 h之間表達量顯著升高，這8個基因表達量的最高峰出現(xiàn)在不同的時間節(jié)點，但又主要集中在6 h和12 h之間，表明它們在擬穴青蟹抗

9、氧化系統(tǒng)整個通路中是相互作用但又相對獨立。本章研究的與抗氧化相關(guān)的8個基因普遍存在于擬穴青蟹的不同組織中，以及它們在弧菌感染后的變化規(guī)律暗示了它們可能在擬穴青蟹抗氧化和免疫防御中起著重要的作用。
　　綜上所述，本研究獲得了擬穴青蟹SpTrx1基因cDNA全長，并且發(fā)現(xiàn)SpTrx1的mRNA表達變化與TrxR的活性變化在不同組織以及副溶血弧菌刺激后都表現(xiàn)出高度一致性，表明SpTrx1和TrxR在擬穴青蟹硫氧還蛋白系統(tǒng)中協(xié)同作用，相輔