擬穴青蟹絲氨酸蛋白酶同系物基因的克隆及其免疫功能鑒定.pdf

1、擬穴青蟹等無脊椎動物依靠先天免疫系統(tǒng)識別、抵御入侵病原微生物，該防御過程需要宿主多種蛋白酶參與反應(yīng)。絲氨酸蛋白酶及其同系物是生物體內(nèi)重要的酶分子，它們不僅參與機體消化、胚胎發(fā)育、組織重建、細胞分化及血管形成等過程，而且在抵御病原菌入侵過程亦發(fā)揮重要作用。前期研究中，通過擬穴青蟹血細胞裂解上清液與病原菌互作技術(shù)分離獲得了能夠識別結(jié)合副溶血性弧菌的擬穴青蟹絲氨酸蛋白酶同系物(Sp-SPH)蛋白，為進一步了解Sp-SPH蛋白在擬穴青蟹識別和清

2、除入侵病原菌過程中的作用，開展了該項研究并取得如下成果:
　　 1.克隆獲得擬穴青蟹Sp-SPH基因全長cDNA。該基因的cDNA全長為1298bp，其中開放閱讀編碼框(ORF)1107 bp，5’端非翻譯區(qū)78 bp，3’端非翻譯區(qū)110bp，3’端非翻譯區(qū)具有典型的Poly(A)末端。
　　 2.構(gòu)建了Sp-SPH基因的真核重組表達載體pPIC9K-Sp-SPH，利用親和層析純化獲得重組表達Sp-SPH蛋白。

3、　　 3.Sp-SPH蛋白能夠識別不同病原菌:利用Western blotting方法檢測體外重組表達Sp-SPH蛋白識別不同病原菌的結(jié)合活性，結(jié)果顯示重組Sp-SPH蛋白能夠識別多種病原菌（嗜水氣單胞菌，大腸桿菌模式株，金黃色葡萄球菌，河流弧菌，哈氏弧菌，副溶血弧菌）;ELISA檢測Sp-SPH蛋白與細菌或真菌細胞壁組分結(jié)合特性實驗發(fā)現(xiàn)Sp-SPH蛋白能夠識別并結(jié)合細菌細胞壁組分LPS、PGN及真菌細胞壁組分β-1，3-葡聚糖，其結(jié)

4、合能力具有一定的蛋白濃度相關(guān)性。
　　 4.Sp-SPH蛋白參與擬穴青蟹酚氧化酶原系統(tǒng)的激活。酚氧化酶原系統(tǒng)激活實驗顯示:加入Sp-SPH蛋白樣品的酚氧化酶活性是只有血細胞裂解上清液(HLS)對照樣品的2.5倍左右，并具有顯著性差異(P＜0.05)。結(jié)合3中研究結(jié)果，證明Sp-SPH蛋白識別病原菌后能夠激活擬穴青蟹重要先天免疫防御系統(tǒng)-酚氧化酶原系統(tǒng)，從而確定Sp-SPH蛋白是青蟹酚氧化酶原系統(tǒng)激活的重要輔助因子。
　　

5、 5.Sp-SPH重組蛋白能夠促進擬穴青蟹血細胞的粘附活性，并具有一定程度的濃度相關(guān)性，且在Sp-SPH蛋白濃度為48μg/mL時檢測到較高的細胞粘附活性，顯微鏡觀察結(jié)果也表明該濃度Sp-SPH蛋白樣品中的血細胞粘附數(shù)量明顯多于對照組。
　　 6.Sp-SPH蛋白能夠增強擬穴青蟹抵御特定致病菌感染的保護力。分別選取嗜水氣單胞菌（與Sp-SPH蛋白較強結(jié)合）、副溶血性弧菌（與Sp-SPH蛋白較弱結(jié)合）和解藻弧菌（不與Sp-SPH蛋