海水青鳉兩種hepcidin基因鐵過(guò)量和LPS刺激下表達(dá)模式差異研究.pdf

1、Hepcidin是一類具有鐵調(diào)節(jié)功能的抗菌肽，在魚類、兩棲類和哺乳動(dòng)物間高度保守。與人類不同，一些魚類存在多種hepcidin基因變體。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)海水青鳉兩種基因變體hepcidin1（OM-hep1）和hepcidin2（OM-hep2）在細(xì)菌感染時(shí)，其組織表達(dá)特性有差異，提示不同變體可能具有不同的生物學(xué)功能。而現(xiàn)有研究表明hepcidin基因在鐵過(guò)量和免疫刺激下都會(huì)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)在LPS刺激下，hepcidin的誘導(dǎo)表達(dá)通

2、常經(jīng)由核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的信號(hào)通路調(diào)控。為闡明OM-hep1和OM-hep2表達(dá)差異的生物學(xué)意義，本文探究了LPS刺激和鐵過(guò)量下這兩種變體的表達(dá)模式，并在克隆獲得NF-κB的基礎(chǔ)上，研究了兩種不同基因變體表達(dá)模式的差異與NF-κB的關(guān)系，為進(jìn)一步研究hepcidin在魚類先天性免疫中的作用機(jī)制提供了有價(jià)值的數(shù)據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.用Real-timePCR(qPCR)定量分析了海水青鳉兩種hepcidin變體（OM

3、-hep1和OM-hep2）在不同發(fā)育階段的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，OM-hep1和OM-hep2表達(dá)模式不同。OM-hep1在胚胎發(fā)育早期(受精后1d，4d)表達(dá)處于低水平，OM-hep2在整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程表達(dá)維持低水平。在幼魚發(fā)育階段，雖然兩者表達(dá)量均在16d達(dá)到最高值，但是OM-hep2在其他階段表達(dá)水平普遍較低，OM-hep1則維持中等水平。在LPS刺激下，發(fā)現(xiàn)OM-hep2在肝臟和脾臟中被顯著的誘導(dǎo)表達(dá)，在鰓中卻下調(diào)表達(dá);而OM-

4、hep1在這三個(gè)組織器官中都顯著下調(diào)表達(dá);鐵過(guò)量狀態(tài)下，肝臟中OM-hep1表達(dá)水平明顯上調(diào)，而在腸中沒(méi)有顯著變化，但OM-hep2表達(dá)水平在肝臟和腸中均明顯下降。OM-hep1和OM-hep2的表達(dá)模式基本相反，且各自在LPS刺激或右旋糖酐鐵注射后的表達(dá)變化不同，表明OM-hep1和OM-hep2可能具有不同的生物學(xué)功能。
　　 2.克隆獲得了海水青鳉核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的三個(gè)亞單位(p65，NF-κB1，NF-κB2)部分基

5、因序列，并分析了其表達(dá)特性。對(duì)NF-κB三個(gè)亞單位的序列分析表明NF-κB三個(gè)亞單位與多種魚類同源性較高，其中與青鳉（Oryziaslatipes）的同源性最高，氨基酸相似度分別達(dá)87.64％，97.37％，95.27％。對(duì)其氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，各自都擁有一個(gè)高度保守的Rel同源區(qū)RHD。用Real-timePCR定量分析表明，NF-κB三個(gè)亞單位在多個(gè)組織器官和不同發(fā)育階段均有表達(dá)，但表達(dá)模式存在差異。在LPS刺激96h的時(shí)相中，

6、肝臟、脾臟和鰓中的p65和NF-κB1基因均在刺激早期即顯著上調(diào)，而NF-κB2的誘導(dǎo)表達(dá)相對(duì)滯后。
　　 3.LPS刺激下，OM-hep2與NF-κB的表達(dá)變化相一致，而OM-hep1與之相反，顯示NF-κB可能參與OM-hep2的誘導(dǎo)表達(dá)。進(jìn)一步用NF-κB抑制劑PDTC探討了LPS介導(dǎo)的hepcidin表達(dá)模式差異與NF-κB基因表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果顯示，PDTC處理使OM-hep2表達(dá)被抑制，而OM-hep1的表達(dá)卻被誘導(dǎo)，