肺炎克雷伯桿菌的分離鑒定及其對(duì)小鼠的致病性研究.pdf

1、肺炎克雷伯桿菌（Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae，KP）是自然界常在菌，屬條件致病菌。它可引起急性人畜共患傳染病，該病常發(fā)生于豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、貂、熊貓、等多種家畜、家禽及野生動(dòng)物。同時(shí)也是造成無(wú)特定病原體動(dòng)物(specificpathogenfreeanimals，SPF)污染的主要微生物之一。對(duì)于實(shí)驗(yàn)大、小鼠，尤其是當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)（不良環(huán)境、進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)），常因感染肺炎克

2、雷伯桿菌而影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量及干擾動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，甚至因大批動(dòng)物死亡而造成損失，嚴(yán)重影響到教學(xué)及科研研究。
　　國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB14926-2001)規(guī)定，肺炎克雷伯桿菌是SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大、小鼠必須檢測(cè)并排除的病原體。常規(guī)檢測(cè)需要采樣、培養(yǎng)、染色、生化反應(yīng)等多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，要數(shù)天才能出結(jié)果，而且工作量大。為了能滿(mǎn)足SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺炎克雷伯桿菌快速、高通量檢測(cè)的迫切要求，特進(jìn)行本課題的研究。
　　本研究結(jié)合微生物學(xué)、病理學(xué)等方法，利用聚合

3、酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測(cè)小鼠肺炎克雷伯桿菌，通過(guò)試驗(yàn)的特異性、敏感性測(cè)定及臨床樣本的檢測(cè)、驗(yàn)證，首次建立了快速、精確檢測(cè)小鼠肺炎克雷伯桿菌基因的方法，為SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠微生物質(zhì)量控制，及肺炎克雷伯桿菌感染臨床診斷提供一種新的有效工具。
　　根據(jù)肺炎克雷伯桿菌phoE基因的序列，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增phoE基因片段，對(duì)KP和鏈球菌（Streptococcus）、

4、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、沙門(mén)氏菌（Salmonella）、大腸埃希菌(Escherichiacoli)、巴氏桿菌（Pasteurella）等其他非KP菌株提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。KP的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)特異性DNA擴(kuò)增片段，而其他非KP均未出現(xiàn)擴(kuò)增片段，該P(yáng)CR體系能檢測(cè)出107pgKP-DNA，從提取DNA到PCR擴(kuò)增及電泳結(jié)束僅需4h。用PCR對(duì)123份臨床樣品進(jìn)行了檢測(cè)，檢出率為2.44％(3/1

5、23)，與細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果的符合率為99.19％。
　　本研究采用生化試驗(yàn)結(jié)合PCR方法等從疑似KP感染的患鼠中分離出的一株細(xì)菌進(jìn)行鑒定，確定為肺炎克雷伯桿菌KP(KPm0912)。用分離菌株KPm0912和標(biāo)準(zhǔn)菌株KP1300分別接種ICR小鼠，建立了KP感染的小鼠動(dòng)物模型，從臨床癥狀、大體病理變化、細(xì)菌學(xué)檢查和組織病理學(xué)四個(gè)方面進(jìn)行研究，探討了KP的致病性。KPm0912對(duì)ICR小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為1.1×105CFU

6、/ml;KP1300對(duì)ICR小鼠的半數(shù)致死量(LD50)為1.3×106CFU/ml。感染鼠發(fā)生皮下膿腫;胸腔內(nèi)出現(xiàn)膠凍樣滲出，肺臟淤血，水腫;肝、脾等實(shí)質(zhì)器官可見(jiàn)不同程度的腫脹，充血以及漿膜面出現(xiàn)膿性滲出物。在病理組織切片中，肺、肝、脾等組織中均可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　以上試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究建立的PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、省時(shí)等特點(diǎn)。該方法操作簡(jiǎn)單，便于疾病發(fā)生時(shí)的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查，適合SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)