Sonic hedgehog信號(hào)調(diào)控BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化.pdf

1、目的：
　　分析Sonic hedgehog（Shh）信號(hào)對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（Bone Morphogenetic Proteins9，BMP9）調(diào)控的間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）骨向分化的影響，并探究這種作用的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　　BMP9處理MSCs，1、3、5 d后，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)Hedgehog（Hh）信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá)。緊接著，用cy

2、clopamine（Hh信號(hào)抑制劑）和purmorphamine（Hh信號(hào)激活劑）分別作用于BMP9處理的MSCs，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)早期成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）活性，茜素紅S染色檢測(cè)晚期的鈣鹽沉積。包裝腺病毒Ad-Shh（過(guò)表達(dá)Shh）和Ad-siShh（干擾Shh），RT-PCR和Western Blot分析病毒效果。隨后分別檢測(cè)Ad-Shh和Ad-siShh對(duì)BMP9調(diào)控的MSCs骨向分化的作用：化學(xué)發(fā)光和細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)ALP變

3、化；茜素紅S染色檢測(cè)鈣鹽沉積；RT-PCR和Western Blot檢測(cè)晚期成骨標(biāo)志物骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）和骨鈣素（Osteocalcin，OCN）以及BMP9下游成骨相關(guān)基因Dlx5、Runx2、Id1、Id2、Id3、CTGF和Col1的表達(dá)；Micro-CT以及組織細(xì)胞染色（H＆E、Masson三色和阿辛藍(lán)）觀察Ad-Shh對(duì)BMP9引起的裸鼠皮下異位成骨的影響。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè) Ad-Shh對(duì) BM

4、P9誘導(dǎo)的 Smad1/5/8轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的影響；Western Blot檢測(cè)Ad-Shh對(duì)BMP9誘導(dǎo)的Smad1/5/8、MAPK磷酸化以及總的Smad1/5/8和磷酸化Smad1/5/8核內(nèi)聚集的影響。
　　結(jié)果：
　　BMP9可影響Hh信號(hào)相關(guān)基因的表達(dá)；抑制或激活Hh信號(hào)可減弱或增強(qiáng)BMP9所導(dǎo)致的MSCs向成骨細(xì)胞分化。Ad-Shh增強(qiáng)了BMP9誘導(dǎo)的體外骨向分化過(guò)程，促進(jìn)了BMP9誘導(dǎo)的體內(nèi)成骨包塊形成；相反，