蜜蜂保幼激素終端合成相關(guān)酶基因分子克隆、鑒定及其在級型發(fā)育過程中的表達研究.pdf

1、蜜蜂Apis mellifera作為高度真社會性昆蟲，已成為社會生物學(xué)研究的模式生物。社會性昆蟲的生殖勞動分工具有重要的進化意義，而級型分化是形成生殖勞動分工的基礎(chǔ)。已有的研究成果為人們描繪出一個相對完善的級型分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，仍有許多問題值得進一步探索，例如:影響級型分化各分表型——個體大小、發(fā)育時長、卵巢大小——的具體分子機制;保幼激素等重要內(nèi)分泌因子的產(chǎn)生和作用的具體分子途徑等。本研究借助新一代高通量測序技術(shù)，檢測了蜜蜂蜂王和工

2、蜂幼蟲級型發(fā)育過程基因表達譜。同時，克隆和鑒定了蜜蜂保幼激素(juvenile hormone，JH)生物合成終端步驟相關(guān)3種酶基因——保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AmJHAMT、細胞色素P45015A1基因AmCYP15A1和法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AmFAMeT,并結(jié)合蜜蜂級型發(fā)育過程分析了這3個基因可能發(fā)揮的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于新一代測序技術(shù)的蜜蜂級型分化數(shù)字化基因表達譜
　　本研究采用基于Illumina/

3、Solexa高通量測序技術(shù)的數(shù)字化基因表達譜方法(digital gene expression profile，DGE)，檢測了西方蜜蜂蜂王和工蜂幼蟲級型發(fā)育表達譜。分別從蜂王和工蜂兩個DGE測序文庫中獲得了約760萬和890萬的可靠標(biāo)簽，相應(yīng)的獨立標(biāo)簽數(shù)目分別約為8.7萬和10.0萬。差異基因表達分析揭示，在蜂王幼蟲中分別有1278個顯著上調(diào)表達基因以及1451個顯著下調(diào)表達基因，在最顯著上調(diào)的50個基因中，多數(shù)是代謝酶類基因，同時

4、還包括2個參與保幼激素合成的基因——JHAMT和CYP15A1。相對地，工蜂幼蟲最顯著上調(diào)的基因僅有少數(shù)是代謝酶類基因。有62，417個無法比對到參考標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫的獨立標(biāo)簽唯一比對到蜜蜂基因組序列中，運用Genscan對它們進行基因預(yù)測，獲得了9，258個候選基因，其中有3，566個候選基因長度超過300 nt。GO分析揭示這些候選基因可能參與胚后發(fā)育、生殖發(fā)育和有性生殖等生理過程。
　　2.蜜蜂JHAMT酶基因分子克隆、鑒定及其在

5、級型分化中的功能研究
　　保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(juvenile hormone acid methyltransferase，JHAMT)是一種參與昆蟲體內(nèi)保幼激素終端合成步驟的酶，它將來源于S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到法尼酸（farnesoic acid，F(xiàn)A）(或保幼激素酸，juvenile hormone acid，JHA)的羧基上。運用RACE技術(shù)克隆了西方

6、蜜蜂JHAMT基因——AmJHAMT的全長cDNA，其長度為1253 bp，編碼一個278aa的蛋白質(zhì)，該蛋白與已知的JHAMT蛋白有32％-36％的序列一致性。AmJHAMT包含在SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶超家族中保守的SAM結(jié)合基序——“基序Ⅰ”。它的二級結(jié)構(gòu)同樣包含SAM甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員典型的核心折疊。同時，那些與SAM及酶促底物——FA或JHA——結(jié)合的活性位點在AmJHAMT序列中仍然保守。在大腸桿菌中表達了AmJHAMT蛋白

7、，并用重組蛋白制備了相應(yīng)的多克隆抗體;運用免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)進一步驗證了預(yù)測的AmJHAMT蛋白氨基酸序列的正確性。熒光定量PCR和免疫印跡分析顯示，在級型發(fā)育過程中，蜂王比工蜂表達更多的AmJHAMT mRNA和蛋白質(zhì);同時，蜂王與工蜂的AmJHAMTmRNA和蛋白質(zhì)時序表達譜與JH滴度變化保持相似的波動模式。
　　3.蜜蜂CYP15A1酶基因分子克隆、鑒定及其在級型分化過程中的表達
　　細胞色素P450超家族（cytoc

8、hrome P450 superfamily, CYP）的CYP15家族成員（如CYP15A1）催化昆蟲JH終端合成步驟的環(huán)氧化反應(yīng)(oxidation)，使甲基法尼酯(methy1 farnesoate，MF)轉(zhuǎn)變?yōu)镴H。本研究從西方蜜蜂幼蟲中克隆了包含完整ORF的CYP15A1基因——AmCYP15A1，其ORF長為1515 bp，編碼含504 aa的蛋白。多重比對分析發(fā)現(xiàn)，AmCYP15A1與多數(shù)昆蟲CYP15序列一致性低于50％

9、，然而AmCYP15A1以及其他昆蟲CYP15蛋白都含有構(gòu)成CYP蛋白一般結(jié)構(gòu)折疊相應(yīng)的基序，以及N端膜錨及鉸鏈等CYPs特征結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，AmCYP15A1先后與來自膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、蜚蠊目、半翅目以及虱目昆蟲的CYP15s聚集成為一個主進化枝，而鱗翅目昆蟲CYP15s獨立構(gòu)成另一個主進化枝。在級型發(fā)育過程的絕大多數(shù)時期，蜂王中的AmCYP1A1 mRNA表達豐度顯著高于工蜂，尤其是在級型發(fā)育的關(guān)鍵窗口期（也稱

10、JH敏感期）。另一方面，從表達趨勢上來看，無論是在蜂王，還是在工蜂中，AmCYP15A1基因表達豐度均在幼蟲L5F時期達到峰值，隨后迅速下降，直至Pw期呈現(xiàn)很低的表達水平，這與末齡期-蛹期過程JH滴度變化保持一致。
　　4.蜜蜂FAMeT酶基因分子克隆、鑒定及其在級型發(fā)育過程中的表達
　　法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Farnesoic acid O-methyltransferase，F(xiàn)AMeT）被認為參與JH終端合成過程——FAMe

11、T以SAM為輔助因子催化FA轉(zhuǎn)變?yōu)镸F。本研究從西方蜜蜂幼蟲中成功克隆得到FAMeT基因——A mFAMeT,其cDNA ORF長為891 bp，編碼含296aa蛋白。多重比對分析表明，AmFAMeT與來自昆蟲的FAMeT序列具有更高的一致性（54％-85％），而與甲殼動物的序列一致性較低(＜50％)。比較AmFAMeT基因在蜂王和工蜂幼蟲相同發(fā)育階段的表達豐度可知，在多數(shù)情況下，二者AmFAMeT表達水平無顯著差異，同時，基因表達趨勢