蜜蜂保幼激素終端合成相關(guān)酶基因分子克隆、鑒定及其在級(jí)型發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)研究.pdf

1、蜜蜂Apis mellifera作為高度真社會(huì)性昆蟲(chóng)，已成為社會(huì)生物學(xué)研究的模式生物。社會(huì)性昆蟲(chóng)的生殖勞動(dòng)分工具有重要的進(jìn)化意義，而級(jí)型分化是形成生殖勞動(dòng)分工的基礎(chǔ)。已有的研究成果為人們描繪出一個(gè)相對(duì)完善的級(jí)型分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。然而，仍有許多問(wèn)題值得進(jìn)一步探索，例如:影響級(jí)型分化各分表型——個(gè)體大小、發(fā)育時(shí)長(zhǎng)、卵巢大小——的具體分子機(jī)制;保幼激素等重要內(nèi)分泌因子的產(chǎn)生和作用的具體分子途徑等。本研究借助新一代高通量測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)了蜜蜂蜂王和工

2、蜂幼蟲(chóng)級(jí)型發(fā)育過(guò)程基因表達(dá)譜。同時(shí)，克隆和鑒定了蜜蜂保幼激素(juvenile hormone，JH)生物合成終端步驟相關(guān)3種酶基因——保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AmJHAMT、細(xì)胞色素P45015A1基因AmCYP15A1和法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶基因AmFAMeT,并結(jié)合蜜蜂級(jí)型發(fā)育過(guò)程分析了這3個(gè)基因可能發(fā)揮的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于新一代測(cè)序技術(shù)的蜜蜂級(jí)型分化數(shù)字化基因表達(dá)譜
　　本研究采用基于Illumina/

3、Solexa高通量測(cè)序技術(shù)的數(shù)字化基因表達(dá)譜方法(digital gene expression profile，DGE)，檢測(cè)了西方蜜蜂蜂王和工蜂幼蟲(chóng)級(jí)型發(fā)育表達(dá)譜。分別從蜂王和工蜂兩個(gè)DGE測(cè)序文庫(kù)中獲得了約760萬(wàn)和890萬(wàn)的可靠標(biāo)簽，相應(yīng)的獨(dú)立標(biāo)簽數(shù)目分別約為8.7萬(wàn)和10.0萬(wàn)。差異基因表達(dá)分析揭示，在蜂王幼蟲(chóng)中分別有1278個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)基因以及1451個(gè)顯著下調(diào)表達(dá)基因，在最顯著上調(diào)的50個(gè)基因中，多數(shù)是代謝酶類基因，同時(shí)

4、還包括2個(gè)參與保幼激素合成的基因——JHAMT和CYP15A1。相對(duì)地，工蜂幼蟲(chóng)最顯著上調(diào)的基因僅有少數(shù)是代謝酶類基因。有62，417個(gè)無(wú)法比對(duì)到參考標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)的獨(dú)立標(biāo)簽唯一比對(duì)到蜜蜂基因組序列中，運(yùn)用Genscan對(duì)它們進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，獲得了9，258個(gè)候選基因，其中有3，566個(gè)候選基因長(zhǎng)度超過(guò)300 nt。GO分析揭示這些候選基因可能參與胚后發(fā)育、生殖發(fā)育和有性生殖等生理過(guò)程。
　　2.蜜蜂JHAMT酶基因分子克隆、鑒定及其在

5、級(jí)型分化中的功能研究
　　保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(juvenile hormone acid methyltransferase，JHAMT)是一種參與昆蟲(chóng)體內(nèi)保幼激素終端合成步驟的酶，它將來(lái)源于S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine，SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到法尼酸（farnesoic acid，F(xiàn)A）(或保幼激素酸，juvenile hormone acid，JHA)的羧基上。運(yùn)用RACE技術(shù)克隆了西方

6、蜜蜂JHAMT基因——AmJHAMT的全長(zhǎng)cDNA，其長(zhǎng)度為1253 bp，編碼一個(gè)278aa的蛋白質(zhì)，該蛋白與已知的JHAMT蛋白有32％-36％的序列一致性。AmJHAMT包含在SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶超家族中保守的SAM結(jié)合基序——“基序Ⅰ”。它的二級(jí)結(jié)構(gòu)同樣包含SAM甲基轉(zhuǎn)移酶超家族成員典型的核心折疊。同時(shí)，那些與SAM及酶促底物——FA或JHA——結(jié)合的活性位點(diǎn)在AmJHAMT序列中仍然保守。在大腸桿菌中表達(dá)了AmJHAMT蛋白

7、，并用重組蛋白制備了相應(yīng)的多克隆抗體;運(yùn)用免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了預(yù)測(cè)的AmJHAMT蛋白氨基酸序列的正確性。熒光定量PCR和免疫印跡分析顯示，在級(jí)型發(fā)育過(guò)程中，蜂王比工蜂表達(dá)更多的AmJHAMT mRNA和蛋白質(zhì);同時(shí)，蜂王與工蜂的AmJHAMTmRNA和蛋白質(zhì)時(shí)序表達(dá)譜與JH滴度變化保持相似的波動(dòng)模式。
　　3.蜜蜂CYP15A1酶基因分子克隆、鑒定及其在級(jí)型分化過(guò)程中的表達(dá)
　　細(xì)胞色素P450超家族（cytoc

8、hrome P450 superfamily, CYP）的CYP15家族成員（如CYP15A1）催化昆蟲(chóng)JH終端合成步驟的環(huán)氧化反應(yīng)(oxidation)，使甲基法尼酯(methy1 farnesoate，MF)轉(zhuǎn)變?yōu)镴H。本研究從西方蜜蜂幼蟲(chóng)中克隆了包含完整ORF的CYP15A1基因——AmCYP15A1，其ORF長(zhǎng)為1515 bp，編碼含504 aa的蛋白。多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，AmCYP15A1與多數(shù)昆蟲(chóng)CYP15序列一致性低于50％

9、，然而AmCYP15A1以及其他昆蟲(chóng)CYP15蛋白都含有構(gòu)成CYP蛋白一般結(jié)構(gòu)折疊相應(yīng)的基序，以及N端膜錨及鉸鏈等CYPs特征結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)發(fā)生分析顯示，AmCYP15A1先后與來(lái)自膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、蜚蠊目、半翅目以及虱目昆蟲(chóng)的CYP15s聚集成為一個(gè)主進(jìn)化枝，而鱗翅目昆蟲(chóng)CYP15s獨(dú)立構(gòu)成另一個(gè)主進(jìn)化枝。在級(jí)型發(fā)育過(guò)程的絕大多數(shù)時(shí)期，蜂王中的AmCYP1A1 mRNA表達(dá)豐度顯著高于工蜂，尤其是在級(jí)型發(fā)育的關(guān)鍵窗口期（也稱

10、JH敏感期）。另一方面，從表達(dá)趨勢(shì)上來(lái)看，無(wú)論是在蜂王，還是在工蜂中，AmCYP15A1基因表達(dá)豐度均在幼蟲(chóng)L5F時(shí)期達(dá)到峰值，隨后迅速下降，直至Pw期呈現(xiàn)很低的表達(dá)水平，這與末齡期-蛹期過(guò)程JH滴度變化保持一致。
　　4.蜜蜂FAMeT酶基因分子克隆、鑒定及其在級(jí)型發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)
　　法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Farnesoic acid O-methyltransferase，F(xiàn)AMeT）被認(rèn)為參與JH終端合成過(guò)程——FAMe

11、T以SAM為輔助因子催化FA轉(zhuǎn)變?yōu)镸F。本研究從西方蜜蜂幼蟲(chóng)中成功克隆得到FAMeT基因——A mFAMeT,其cDNA ORF長(zhǎng)為891 bp，編碼含296aa蛋白。多重比對(duì)分析表明，AmFAMeT與來(lái)自昆蟲(chóng)的FAMeT序列具有更高的一致性（54％-85％），而與甲殼動(dòng)物的序列一致性較低(＜50％)。比較AmFAMeT基因在蜂王和工蜂幼蟲(chóng)相同發(fā)育階段的表達(dá)豐度可知，在多數(shù)情況下，二者AmFAMeT表達(dá)水平無(wú)顯著差異，同時(shí)，基因表達(dá)趨勢(shì)