刺梨APX基因的克隆及其在AsA積累過(guò)程中的表達(dá).pdf

1、刺梨(RosaroxburghiiTratt)是原產(chǎn)于我國(guó)的新興水果，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其最大特點(diǎn)是富含維生素C(AsA)。以貴農(nóng)五號(hào)刺梨為材料，研究了果實(shí)發(fā)育過(guò)程中、機(jī)械傷處理過(guò)程中以及采后儲(chǔ)藏過(guò)程中維生素C的積累變化與相關(guān)酶活性的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上采用RT-PCR方法克隆APX基因的主要cDNA序列，并分析其在維生素C積累過(guò)程中的表達(dá)，可為從分子水平闡明刺梨積累高含量維生素C的分子機(jī)理提供更多信息，研究結(jié)果如下： 刺梨果實(shí)發(fā)

2、育過(guò)程中總AsA積累速度呈“慢-快-慢”的模式，從6月底到8月初是AsA積累最快的時(shí)期；此外刺梨其它器官中總AsA的含量有所差異，莖的含量最高，葉片和花的含量次之，根的含量最低。兩種主要AsA氧化酶AAO和APX只在果實(shí)發(fā)育前期表現(xiàn)活性，且活性較弱。除了幼果之外的其它器官都不能檢測(cè)到AAO、APX的活性。 根據(jù)GenBank中登錄的其它植物cAPX基因保守序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到約418bpcDNA片段。經(jīng)序列分

3、析表明，該片段編碼的氨基酸序列與薔薇、草莓、黃瓜、花生和豌豆等植物cAPX序列的相似性高達(dá)87％-97％。 RT-PCR分析表明，刺梨cAPX基因表達(dá)呈明顯的器官特異性，在果實(shí)、葉片和花中表達(dá)較強(qiáng)，在根中次之，而在莖中表達(dá)極其微弱。此外，在不同發(fā)育時(shí)期的刺梨果實(shí)中都能檢測(cè)到cAPX基因的mRNA，但隨著發(fā)育進(jìn)程cAPX基因的表達(dá)呈弱-強(qiáng)-弱的趨勢(shì)。在果實(shí)逐漸成熟時(shí)期，cAPX基因仍有較弱的表達(dá)，雖然檢測(cè)不到APX酶活性，此時(shí)As

4、A積累量最多；其表達(dá)模式與APX活性變化基本一致。 刺梨果實(shí)采后于不同溫度下儲(chǔ)藏過(guò)程中，其總AsA含量呈緩慢下降趨勢(shì)，但4℃下的下降速度較慢，儲(chǔ)藏64d后總AsA含量只減少了約27％；而20℃下AsA(還原型)含量在儲(chǔ)藏的最初2d內(nèi)有所升高，隨后下降。但令人意外的是，在兩種溫度下儲(chǔ)藏的果實(shí)中均未能檢測(cè)到APX、AAO的活性，cAPX基因的表達(dá)也極為微弱。相對(duì)而言，20℃下cAPX基因表達(dá)比4℃下更強(qiáng)，這與AsA分解速度基本一致。

5、 機(jī)械傷處理過(guò)程中，刺梨果實(shí)AsA含量總體呈“慢-快-慢”的下降趨勢(shì)，而DHA的含量持續(xù)增加。在此過(guò)程中cAPX基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，雖然一直未能檢測(cè)到APX或AAO等AsA氧化酶活性。AsA含量分別與O2-。產(chǎn)生速率、MDA含量和H2O2含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)分別為-0.9127**，-0.7472*和-0.7866*)。此外，在傷處理造成的氧化脅迫過(guò)程中，SOD逐漸表現(xiàn)較高的活性，而抗氧化酶系統(tǒng)中的另兩種重要組分POD和

6、CAT卻一直未能檢測(cè)到活性。 以上結(jié)果表明，AsA分解酶AAO和APX只在果實(shí)發(fā)育前期較短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)活性，從而使AsA極少被氧化分解，這可能是刺梨果實(shí)能積累高水平AsA的重要原因之一；在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期都能檢測(cè)到cAPX基因的mRNA，其表達(dá)模式與APX活性變化基本一致。果實(shí)采后儲(chǔ)藏過(guò)程中，cAPX基因有微弱的表達(dá)，20℃下cAPX基因表達(dá)比4℃下更強(qiáng)，這與AsA分解速度基本一致。在果實(shí)機(jī)械傷脅迫下，cAPX基因的表達(dá)模式與As