弓形蟲(chóng)速殖子體外培養(yǎng)及銀杏酸等對(duì)其增殖抑制作用的研究.pdf

1、研究目的： 剛地弓形蟲(chóng)病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人獸共患寄生蟲(chóng)病。不僅對(duì)孕婦和新生兒構(gòu)成了極大的威脅，近年來(lái)又成為AIDS等免疫功能缺陷患者死亡的重要因素之一?，F(xiàn)有的抗弓形蟲(chóng)藥物幾乎都存在遠(yuǎn)期治療效果差、易復(fù)發(fā)、價(jià)格昂貴且對(duì)免疫功能缺陷患者基本無(wú)治療效果等諸多不足，開(kāi)展新型抗弓形蟲(chóng)藥物的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。藥物研究依賴(lài)于高效穩(wěn)定的弓形蟲(chóng)體內(nèi)和體外培養(yǎng)模型，建立弓形蟲(chóng)培養(yǎng)模型不僅可用于篩選新型抗弓形蟲(chóng)藥物，還可用于抗弓形蟲(chóng)

2、藥物的作用機(jī)理研究。 研究方法： 弓形蟲(chóng)速殖子腹腔感染昆明小鼠，建立速殖子體內(nèi)培養(yǎng)模型，并探討了體內(nèi)模型長(zhǎng)期傳代保種的方法。將弓形蟲(chóng)速殖子接種HFF細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，建立速殖子體外培養(yǎng)模型，吉姆薩染色鏡下觀察速殖子在細(xì)胞中增殖的速率。建立速殖子HeLa細(xì)胞連續(xù)傳代保種技術(shù)，探討溫度和時(shí)間對(duì)速殖子產(chǎn)率和活率的影響。 探討胰酶消化法、3 μm濾膜過(guò)濾法、CF-11纖維素過(guò)濾法、Ficoll離心法和Percoll離心

3、法純化體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)模型獲得速殖子的效率。 以速殖子HFF細(xì)胞培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)，MTT、法測(cè)定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素對(duì)HFF細(xì)胞的安全濃度，MTT法和核素?fù)饺敕ǚ謩e測(cè)定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素對(duì)蟲(chóng)體增殖的抑制效果，并探討藥物的作用機(jī)理。吉姆薩染色鏡下連續(xù)觀察銀杏酸和阿奇霉素對(duì)速殖子的抑制效果。 以速殖子HeLa細(xì)胞培養(yǎng)模型為基礎(chǔ)，MTT法測(cè)定銀杏酸對(duì)HeLa細(xì)胞的安全濃度，觀察不同濃度銀杏酸對(duì)第一代速殖子和第二代速殖

4、子的抑制作用。Real-Time PCR技術(shù)分別測(cè)定銀杏酸、阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星對(duì)第一代和第二代速殖子頂質(zhì)體增殖抑制效果。 研究結(jié)果： 速殖子可在昆明小鼠體內(nèi)傳代保種，每2～3天傳代1次。小鼠腹水中速殖子可在液氮中保存2年以上。RH株速殖子可在HFF細(xì)胞和HeLa細(xì)胞內(nèi)增殖。HFF細(xì)胞接種速殖子后72 h即可被完全破壞，而HeLa細(xì)胞則需要96 h才被完全破壞，速殖子在HFF細(xì)胞內(nèi)增殖速度明顯快于HeLa細(xì)胞。速

5、殖子在HeLa細(xì)胞內(nèi)可進(jìn)行連續(xù)傳代保種，目前已傳至十代以上。蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)增殖速度和傳代時(shí)間穩(wěn)定、形態(tài)良好，未見(jiàn)毒力明顯減弱。在速殖子體外培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，將培養(yǎng)于HeLa細(xì)胞中速殖子首先置于37℃培養(yǎng)72 h，再置于25℃培養(yǎng)120 h后，速殖子的產(chǎn)率達(dá)40倍以上，且活率大于90％，殘留很少量Hela細(xì)胞。 5種純化方法中，以胰酶消化法的速殖子回收率最高，體內(nèi)和體外培養(yǎng)速殖子的回收率分別為109.46％和90.96％。Ficoll

6、離心法的回收率最低，體內(nèi)和體外培養(yǎng)速殖子的回收率分別為0.36％和0.19％。3μm濾膜過(guò)濾法和CF-11纖維素過(guò)濾法都可以完全清除蟲(chóng)體懸液中的白細(xì)胞，但對(duì)紅細(xì)胞的清除效果不明顯CF-11纖維素過(guò)濾法的回收率高于3 μm濾膜；但3 μm濾膜過(guò)濾法方便快捷。Ficoll離心法對(duì)紅細(xì)胞清除效果較好，但蟲(chóng)體回收率很低；而Percoll離心法蟲(chóng)體回收率較高，但對(duì)紅細(xì)胞的清除效果不理想。 MTT法和核素?fù)饺敕y(cè)定銀杏酸、阿奇霉素和大蒜素的

7、體外抗弓形蟲(chóng)效果顯示，銀杏酸的抗蟲(chóng)效果與阿奇霉素相近，銀杏酸對(duì)HFF細(xì)胞毒性略低于阿奇霉素。通過(guò)吉姆薩染色觀察到銀杏酸和阿奇霉素均可在8 h內(nèi)完全清除HFF細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)的速殖子。核素?fù)饺敕ńY(jié)果表明，銀杏酸和阿奇霉素的抗蟲(chóng)機(jī)理在于抑制速殖子DNA和蛋白質(zhì)的合成。 以Real-Time PCR研究銀杏酸、阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星對(duì)第一代和第二代速殖子頂質(zhì)體增殖的特異性抑制作用。結(jié)果表明：經(jīng)阿奇霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星處理后的第二代

8、速殖子項(xiàng)質(zhì)體數(shù)量較同代的未用藥處理組明顯降低，但藥物處理后第一代蟲(chóng)體與未處理蟲(chóng)體頂質(zhì)體數(shù)量無(wú)顯著性差異。經(jīng)銀杏酸處理后的第一代與第二代速殖子頂質(zhì)體與同代的用藥處理組之間無(wú)明顯差異，銀杏酸無(wú)特異性抑制頂質(zhì)增殖能力；但經(jīng)銀杏酸處理后的兩代速殖子核基因組拷貝數(shù)較相應(yīng)的未處理組顯著降低。 研究結(jié)論： 弓形蟲(chóng)速殖子體內(nèi)培養(yǎng)模型操作簡(jiǎn)單，蟲(chóng)體增殖率高，但代價(jià)高昂，液氮保種可作為動(dòng)物保種的補(bǔ)充。體外培養(yǎng)模型也能獲得增殖的速殖子，還可用

9、于速殖子連續(xù)傳代保種。體外培養(yǎng)模型實(shí)驗(yàn)成本比體內(nèi)培養(yǎng)模型低，體外培養(yǎng)模型更適用于抗弓形蟲(chóng)藥物的篩選和藥物作用機(jī)理的研究。 胰酶消化法、3μm濾膜過(guò)濾法、CF-11纖維素過(guò)濾法、Ficoll離心法和Percoll離心法均可用于體內(nèi)、體外培養(yǎng)模型速殖子的純化，不同純化方法影響速殖子的回收率和純度，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，選擇合適的速殖子純化方法。 MTT法和核素?fù)饺敕ǘ伎捎糜跍y(cè)定藥物體外抗速殖子增殖效果。MTT法操作簡(jiǎn)單，可以迅

10、速得到結(jié)果，但其結(jié)果不精確，可用于新型藥物的初篩。核素?fù)饺敕`敏度高，結(jié)果精確，是目前國(guó)內(nèi)外篩選藥物殺蟲(chóng)效果的首選方法，但會(huì)造成環(huán)境的放射性污染。 Real-Time PCR技術(shù)可測(cè)定藥物對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子頂質(zhì)體增殖抑制作用，較定量Southern blots方法更為簡(jiǎn)單實(shí)用，可用于篩選特異性抗頂質(zhì)體藥物。 銀杏酸體外對(duì)速殖子的抑制作用與阿奇霉素相近，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ目构蜗x(chóng)藥物。其抗弓形蟲(chóng)速殖子增殖的機(jī)理在于抑制核基因組