弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)換模型的構(gòu)建.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內(nèi)寄生可感染幾乎所有溫血動物的單細胞機會致病性原蟲，可引起人畜共患的弓形蟲病。弓形蟲侵入宿主細胞后，在宿主免疫反應(yīng)作用下，弓形蟲從快速繁殖的速殖子轉(zhuǎn)換為緩慢生長、幾乎休眠狀態(tài)的緩殖子，并形成包囊長期存在于體內(nèi)，以抵抗不良環(huán)境;但當宿主免疫受損或免疫力低下時，如腫瘤患者、AIDS患者等，不良環(huán)境被解除，包囊活化，緩殖子轉(zhuǎn)化為速殖子，引起嚴重弓形蟲病，甚至導(dǎo)致死亡。隨著艾滋病流行

2、范圍的不斷擴大，寵物飼養(yǎng)的興起等，弓形蟲病的危害也日漸突出，成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。
　　速殖子與緩殖子的相互轉(zhuǎn)換是弓形蟲機會致病的生物學(xué)基礎(chǔ)和中心環(huán)節(jié)。雖經(jīng)大量和多年的研究，這種轉(zhuǎn)換機制仍不清楚。因此，探討速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)換機制成為目前弓形蟲病研究的難點和熱點之一。
　　目前，弓形蟲體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換研究主要集中在速殖子向緩殖子的轉(zhuǎn)化，而緩殖子向速殖子的轉(zhuǎn)化報道的較少。本研究通過在體外培養(yǎng)中加入或去除弓形蟲的不良生活因素

3、，構(gòu)建弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)化模型。
　　研究目的:
　　構(gòu)建弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)換模型，為進一步探討弓形蟲病急慢性轉(zhuǎn)換機制打下基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1、常規(guī)復(fù)蘇弓形蟲速殖子，在小鼠體內(nèi)傳代，并用純化的速殖子感染Hela細胞進行體外培養(yǎng)。
　　2、研究外源性壓力條件下速殖子向緩殖子的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換，觀察堿性pH、高溫、CO2饑渴條件下速殖子生的長狀態(tài)，并分時間點收集培養(yǎng)混合物，提取弓形蟲總

4、RNA，采用RT-PCR的方法分別檢測速殖子期特異性基因SAG1和緩殖子期特異性基因BAG1、BSR4。
　　3、探討去除外源性壓力因素恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件后，緩殖子的轉(zhuǎn)歸，并分時間點收集培養(yǎng)混合物，提取弓形蟲總RNA，采用RT-PCR的方法分別檢測速殖子期特異性基因SAG1和緩殖子期特異性基因BAG1、BSR4。
　　研究結(jié)果:
　　1、在43℃條件下細胞迅速崩解難以為蟲體生長提供一個合適的環(huán)境，在41℃下大部分的細胞

5、可以正常生長且可以快速誘導(dǎo)蟲體轉(zhuǎn)化。
　　2、在堿性pH、CO2饑渴、41℃體外培養(yǎng)中誘導(dǎo)蟲體，分時間點檢測期特異性基因，隨著誘導(dǎo)時間的延長，BAG1和BSR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高，SAG1逐漸減少并消失。
　　3.恢復(fù)到正常培養(yǎng)條件后，分時間點收集培養(yǎng)混合物，隨著誘導(dǎo)時間的延長，SAG1mRNA轉(zhuǎn)錄水平逐漸提高.
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了一個穩(wěn)定的弓形蟲速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)化模型，為進一步研究弓形蟲