豬瘟病毒感染宿主外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜的研究.pdf

1、豬瘟病毒(Classical swine fever vires,CSFV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,基因組大小約12.3 kb,只含有一個開放閱讀框,編碼一個由3899個氨基酸組成的多聚蛋白,該蛋白在病毒蛋白酶和宿主細(xì)胞酶的作用下,分解成為4個結(jié)構(gòu)蛋白和8個非結(jié)構(gòu)蛋白。豬是CSFV的惟一宿主,CSFV引起的豬瘟是一種高度接觸性傳染病,具有很高的發(fā)病率和死亡率,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,世界動物組織將其列為A類傳染病之一。

2、r>　　 隨著豬瘟疫苗的廣泛使用,豬瘟由大流行轉(zhuǎn)變?yōu)榈胤叫粤餍谢蛏l(fā),臨床癥狀從典型轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫?出現(xiàn)母豬繁殖障礙和新生仔豬先天性感染。CSFV在疫苗免疫的壓力下,逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別并建立持續(xù)性感染等致病機(jī)制目前尚不清楚,對CSFV與宿主相互作用的研究將為闡明這些機(jī)制提供線索。豬瘟的病程發(fā)展分為潛伏期、前驅(qū)期、明顯期和轉(zhuǎn)歸期四個階段,外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)作

3、為宿主免疫系統(tǒng)的重要組成部分同時又是CSFV感染的靶細(xì)胞,其基因表達(dá)的變化對于豬瘟病程的四個發(fā)展階段極為重要,PBMC基因在這四個發(fā)展階段的動態(tài)和整體的轉(zhuǎn)錄研究將有助于闡明CSFV與宿主的相互作用機(jī)制。
　　 基因芯片可以同時對上萬個基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行研究,獲得的病毒誘導(dǎo)宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄改變的大量信息對研究病毒與宿主的相互作用具有重要的意義。本研究應(yīng)用豬基因組芯片對CSFV感染潛伏期、前驅(qū)期、明顯期和轉(zhuǎn)歸期四個不同感染階段的PBMC

4、基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行檢測,對轉(zhuǎn)錄差異基因的生物學(xué)功能分析將增進(jìn)我們對CSFV與宿主相互作用機(jī)制的了解。
　　 3頭健康豬每頭分別肌肉注射1×106TCID50的CSFV強(qiáng)毒石門株。實驗豬攻毒后,出現(xiàn)高熱稽留、全身廣泛性小點出血、后肢麻痹等典型的豬瘟臨床癥狀,1頭豬在感染后第10天死亡,另2頭在感染后第12天死亡。在病毒感染前實驗豬的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量分別為6.50±0.26x106個/mL和5.97±1.03×105個/mL,在感染

5、后第9天淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量分別減少至2.03±0.45×106個/mL和0.27±0.46×105個/mL。在CSFV感染后第3天從血液檢測到CSFV核酸和蛋白,在CSFV感染后第6天從PBMC中檢測到CSFV核酸和蛋白,并且CSFV的核酸拷貝數(shù)和病毒滴度隨著病程的延長而增多。2頭注射磷酸鹽緩沖液的陰性對照豬在試驗期間均未出現(xiàn)任何豬瘟臨床癥狀,淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量正常,從血液和PBMC中也未檢測到CSFV核酸和蛋白。
　　

6、 在感染前第4天和感染后第1,3,6,9天分離豬的PBMC,抽提總RNA,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和體外轉(zhuǎn)錄得到的cRNA與基因芯片雜交,篩選轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變的基因。芯片分析顯示在病毒感染的整個階段,3頭CSFV感染豬每頭分別有2075、2853和2097個基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變。在3頭豬中都出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄改變的基因有485個;在2頭豬中都出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄改變的基因有688個。利用基因芯片顯著性分析軟件對3頭感染豬的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)有847個基因(占基因芯

7、片上基因總數(shù)的4.19％)的轉(zhuǎn)錄在CSFV感染后發(fā)生2倍以上的顯著改變。847個轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變的基因中,分別有541和306個基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生上調(diào)和下調(diào)。在感染后第1,3,6,9天的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)的數(shù)量分別是54、181、438和354個;基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)的數(shù)量分別是61、120、218和145個。基因的生物學(xué)功能分析顯示,380個基因的生物學(xué)功能未知;余下的467個基因分別參與免疫應(yīng)答(14.5％,123/847)、細(xì)胞凋亡(3.3％,28/8

8、47)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(7.6％,64/847)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控(4.4％,37/847)、新陳代謝(11％,93/847)、轉(zhuǎn)運(3.9％,33/847)、發(fā)育(6.8％,58/847)和細(xì)胞周期(3.7％,31/847)。
　　 為了檢測病原微生物對Ⅰ型干擾素產(chǎn)生途徑的影響,本研究同時建立了檢測豬細(xì)胞因子IFN-α1、IFN-β、IRF-3、IRF-7、TBK1、CREB1和C-Jun基因轉(zhuǎn)錄的熒光定量RT-PCR方法,該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的