紅花玉蘭花器官特征決定的MAwuAP3_1-2基因克隆和功能分析.pdf

1、　　紅花玉蘭(Magnolia wufengensis L.Y.Ma et L.R.Wang)是近年在湖北五峰境內(nèi)發(fā)現(xiàn)的木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia) 新種,其花被片9到32片、型色各異、自然變異豐富,使其成為研究木蘭科植物花器官形態(tài)建成的理想材料。AP3(APETALA3)基因是調(diào)控?cái)M南芥花瓣和雄蕊正常發(fā)育的重要 B 類 MADS-box基因,其同源基因在控制多數(shù)真雙子葉植物和單子葉植物花發(fā)育上有很強(qiáng)的保

2、守性。
　　木蘭科是較原始的被子植物基部類群之一,與其他真雙子葉植物相比,其花器官形態(tài)差異較大。本研究結(jié)合同源克隆和 RACE 技術(shù),從紅花玉蘭中分離得到調(diào)控其雄蕊和被片發(fā)育的B類基因MAwuAP3_1/2。通過(guò)半定量RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)分別分析了其在紅花玉蘭花發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)組織特異性和時(shí)間特異性,并結(jié)合 2 個(gè)基因恢復(fù)擬南芥相應(yīng)突變體(ap3-3 突變體)表型的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析基因功能,旨在探討該類基因在

3、調(diào)控紅花玉蘭花發(fā)育過(guò)程中的主要功能及其早期進(jìn)化。主要結(jié)果如下：
　　(1)紅花玉蘭MAwuAP3_1/2基因克隆和序列結(jié)構(gòu)比較
　　結(jié)合同源克隆方法和 RACE 技術(shù),從紅花玉蘭花芽中分離出 2 個(gè)參與調(diào)控花被和雄蕊發(fā)育的B類MADS-box基因：MAwuAP3_1/2。對(duì)其編碼的蛋白進(jìn)行同源序列比對(duì)和分子系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生分析顯示,MAwuAP3_1/2蛋白的C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)有一個(gè)高度保守的paleoAP3模體,同屬B類

4、基因的paleoAP3進(jìn)化分支；但其缺少AP3/DEF進(jìn)化支中常有的PI-derived 模體,且這兩個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子在其K區(qū)呈現(xiàn)出9個(gè)氨基酸殘基的差異,C區(qū)呈現(xiàn)出4個(gè)氨基酸殘基的差異。
　　(2)紅花玉蘭MAwuAP3_1/2基因的表達(dá)模式比較
　　半定量RT-PCR分析2個(gè)基因在紅花玉蘭花器官中表達(dá)的組織特異性顯示,其僅在花被片和雄蕊中表達(dá),在幼葉、雌蕊中不表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量分析其在花芽不同分化時(shí)期的結(jié)

5、果顯示,MAwuAP3_1基因在花被片和雄蕊的迅速生長(zhǎng)期一直維持很高的轉(zhuǎn)錄水平,而MAwuAP3_2基因僅在花被片和雄蕊分化的初期表達(dá)。2個(gè)基因表達(dá)的組織特異性與其同源基因類似,但其表達(dá)的時(shí)間特異性呈現(xiàn)出明顯的差別。
　　(3)紅花玉蘭MAwuAP3_1/2基因的功能分析
　　在 CaMV 35S 啟動(dòng)子的控制下,將 MAwuAP3_1/2 基因?qū)腚p元表達(dá)載體pBI121,在農(nóng)桿菌介導(dǎo)下,通過(guò)浸花法將其導(dǎo)入擬南芥a

6、p3-3突變體。結(jié)合體視顯微技術(shù)和掃描電鏡技術(shù),對(duì)含35S：：MAwuAP3_1/2的ap3-3純合體擬南芥的表 型分析發(fā)現(xiàn),2個(gè)基因均能部分恢復(fù)ap3-3純合體擬南芥花器官的表型,使其在第 3 輪花器官產(chǎn)生類似雄蕊花絲的結(jié)構(gòu),并使第 2 萼片邊緣瓣化。有趣的是, MAwuAP3_1/2基因過(guò)表達(dá)的ap3-3雜合體和野生型擬南芥中有30%的植株第一朵小花增加了1-3個(gè)花瓣。
　　從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果看,紅花玉蘭MAwuAP3_1/