SigmaB基因缺失對單核細胞增生李斯特菌致病性和環(huán)境應激能力的影響.pdf

1、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性致病菌,生存能力強,存在范圍廣。LM主要通過消化道引起動物和人的急性感染,對畜牧業(yè)和人類健康造成了巨大的威脅,因此,LM被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)列為四大食源性致病菌之一。
　　作為一種典型的細胞內(nèi)寄生致病菌,LM能在專業(yè)和非專業(yè)吞噬細胞內(nèi)生長繁殖,可刺激機體產(chǎn)生特異性的細胞免疫

2、,因而許多研究者希望通過改造LM的毒力基因,使其毒力降低,用作LM弱毒疫苗或抗病毒、抗腫瘤的疫苗活載體。然而,作為疫苗或疫苗活載體,必須要安全可靠。盡管國內(nèi)外學者對LM部分毒力基因進行了改造,但未獲得預期的減毒效果。在LM中,σB因子由SigmaB基因編碼,是RNA聚合酶全酶中的一個亞基,研究表明σB因子對許多毒力基因的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)節(jié)作用,因此本研究通過基因缺失手段構(gòu)建SigmaB基因缺失株,為LM弱毒疫苗和疫苗活載體研發(fā)奠定理論基礎。研

3、究方法和主要結(jié)果如下:
　　1.LM新疆野毒株XS5 SigmaB操縱子的克隆及序列分析
　　根據(jù)GenBank登錄的SigmaB操縱子序列,設計引物,PCR擴增LM新疆野毒株XS5 SigmaB操縱子基因片段,用DNAMAN軟件和在線軟件分析擴增序列所含各基因編碼蛋白的活性位點和高級結(jié)構(gòu)。結(jié)果成功擴增出3000bp的SigmaB操縱子片段,該序列含有rsbV、rsbW、rsbX和SigmaB四個基因,其中SigmaB基因全

4、長801bp,編碼265個氨基酸,8到264位AA為RNA聚合酶全酶中的σB因子區(qū)域,41到110位AA為Sigma70_r2超家族,是整個蛋白質(zhì)中最保守的區(qū)域。SigmaB基因同源性分析顯示,在LM不同菌株之間SigmaB基因的同源性較高,表明該基因具有較高的保守性。
　　2.LM-XS5-△SigmaB缺失株的構(gòu)建與分子鑒定
　　根據(jù)實驗一獲得的SigmaB操縱子測序結(jié)果設計融合PCR引物,運用重疊延伸PCR技術獲得缺失

5、SigmaB基因的融合PCR產(chǎn)物,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔSigmaB,測序。構(gòu)建重組穿梭載體pKSV7-ΔSigmaB。用電擊轉(zhuǎn)化的方法將重組穿梭載體轉(zhuǎn)入LM-XS5感受態(tài)細胞,用PCR方法篩選和鑒定重組菌。結(jié)果成功構(gòu)建了SigmaB基因缺失株(LM-XS5-△SigmaB)。重組缺失株PCR鑒定條帶與預期缺失后的值1502bp相符,測序結(jié)果證實成功缺失了LM-XS5的SigmaB基因。經(jīng)過25代的連續(xù)傳代,PCR鑒定結(jié)果顯示,

6、該缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　3.SigmaB基因缺失對LM致病性和環(huán)境應激能力的影響
　　將野毒株LM-XS5和實驗二構(gòu)建的SigmaB基因缺株LM-XS5-△SigmaB于相同條件下培養(yǎng)后,分別感染巨噬細胞RAW264.7和BALB/C小鼠,通過單菌落計數(shù)、存活小鼠的統(tǒng)計以及Real-time RT-PCR毒力基因表達量檢測的方法來對比缺失株與野毒株的致病性差異。實驗結(jié)果顯示,與野毒株相比,SigmaB基因缺株的粘

7、附率和侵襲率均下降(p<0.05);肝、脾載菌量減少(p<0.05);LD50升高了2.60個對數(shù)數(shù)量級;被檢測的毒力基因表達量均降低。結(jié)果表明缺失SigmaB基因使LM的致病性減弱。用單菌落計數(shù)的方法對比缺失株與野毒株在高溫、高滲透壓和酸堿環(huán)境中應激能力的差異,使用Real-timeRT-PCR的方法檢測環(huán)境應激相關基因的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野毒株相比,SigmaB基因缺失株在不同應激環(huán)境中的活菌數(shù)明顯減少;對環(huán)境應激相關基因(rsb