單核細(xì)胞增生李斯特菌生物被膜形成機(jī)制的轉(zhuǎn)錄水平研究.pdf

1、古人云“民以食為天”，食品是人類(lèi)賴(lài)以生存和發(fā)展的最直接的物質(zhì)條件。中國(guó)還有句俗語(yǔ)“病從口入”，食品安全關(guān)系到全人類(lèi)的生活、生存、延續(xù)，是人類(lèi)發(fā)展的重要課題。近些年來(lái)，食品問(wèn)題逐步演變成一個(gè)社會(huì)熱點(diǎn)問(wèn)題。然而在眾多食品問(wèn)題中微生物引起的食源性疾病是影響食品安全最主要的因素之一。食品及原料表面、管道、運(yùn)輸設(shè)備等表面通常富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物易在此生長(zhǎng)繁殖，形成生物被膜。一旦形成生物被膜，對(duì)消毒劑、殺菌劑的耐受性增強(qiáng)而難以清除，并嚴(yán)重影響著食品

2、衛(wèi)生安全，因此對(duì)生物被膜的研究刻不容緩。
　　食源性致病菌單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)能形成生物被膜，縱觀(guān)國(guó)內(nèi)外的研究，對(duì)Lm生物被膜的研究主要集中在以下幾個(gè)方面:1）建立實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和檢測(cè)Lm生物被膜的標(biāo)準(zhǔn)方法以及分析培養(yǎng)條件（營(yíng)養(yǎng)、溫度、接觸面材料性質(zhì)等）對(duì)Lm生物被膜形成的影響;2）比較不同來(lái)源（比如即時(shí)食品、水產(chǎn)品、臨床等）、不同血清型或者致病譜系(Lineage)的Lm分離株的生

3、物被膜形成能力和形態(tài)上的差別;3）利用各種轉(zhuǎn)座系統(tǒng)獲得生物被膜形成突變株，研究Lm生物被膜形成的相關(guān)基因;4）研究PrfA、SigB等主要調(diào)控因子對(duì)生物被膜形成的影響機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期研究成果表明Lm毒力基因表達(dá)的主要調(diào)控蛋白PrfA能促進(jìn)Lm生物被膜的形成，但具體的分子機(jī)制還未闡明;前期結(jié)果還顯示PrfA活性高低以及培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富程度對(duì)PrfA在Lm生物被膜形成中有顯著影響，而根據(jù)我們的蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果推測(cè)碳代謝物阻遏效應(yīng)(

4、CarbonCataboliteRepression,CCR)的調(diào)控因子CcpA可能參與調(diào)控Lm生物被膜形成，因此，本實(shí)驗(yàn)利用檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平的有效手段——qRT-PCR探究CcpA和PrfA之間的關(guān)系，結(jié)果顯示CcpA與PrfA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能存在負(fù)調(diào)控的關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)還利用微陣列技術(shù)比較研究了EGDe游離態(tài)、被膜態(tài)及EGDeΔPrfA被膜態(tài)全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)的差異，尋找與Lm生物被膜形成相關(guān)的基因以及與PrfA的聯(lián)系，解析PrfA

5、促進(jìn)Lm生物被膜形成的分子機(jī)制。我們的研究顯示:1）營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)細(xì)菌生物被膜相關(guān)基因的表達(dá)影響巨大。與Lm游離菌的全基因轉(zhuǎn)錄水平相比，在營(yíng)養(yǎng)豐富的BHI培養(yǎng)基中，培養(yǎng)了48h后形成的生物被膜細(xì)胞的全基因組轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平十分低下，該條件檢測(cè)出的樣本信號(hào)值強(qiáng)度的中位值和平均值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他樣本;而在營(yíng)養(yǎng)相對(duì)貧瘠的基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEM(添加葡糖糖)中，超過(guò)21.95％(即所檢測(cè)的2857個(gè)基因中發(fā)現(xiàn)627個(gè)Lm生物被膜形成相關(guān)基因)的基因在游離菌和被

6、膜菌中發(fā)生差異表達(dá);2）在627個(gè)Lm生物被膜形成相關(guān)基因中，有185個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)在PrfA缺失菌株形成的生物被膜中發(fā)生了改變。其中，只有10個(gè)基因因?yàn)镻rfA缺失而增強(qiáng)了差異表達(dá)的絕對(duì)值，而其余175個(gè)基因的表達(dá)卻發(fā)生根本的改變，即在野生株形成的生物被膜中上調(diào)的基因在PrfA缺失株形成的生物被膜中卻下調(diào)，反之亦然。PrfA的缺失改變了很多與Lm生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，暗示PrfA調(diào)控Lm生物被膜形成可能是多基因多途徑相互協(xié)調(diào)作

7、用的結(jié)果。
　　本實(shí)驗(yàn)還分別選擇了微陣列結(jié)果中與Lm生物被膜形成相關(guān)基因中的8個(gè)基因做了熒光定量PCR檢測(cè)以及19個(gè)基因做了半定量RT-PCR驗(yàn)證，檢驗(yàn)結(jié)果與芯片結(jié)果顯示的變化趨勢(shì)是吻合的。
　　在今后的工作中我們將挑選多個(gè)與Lm生物被膜形成相關(guān)基因進(jìn)行深入研究，觀(guān)測(cè)這些基因在缺失及回復(fù)條件下生物被膜的形成情況及與PrfA活性的關(guān)系。通過(guò)這些基礎(chǔ)研究我們將要解析與PrfA相關(guān)的、影響生物被膜形成的關(guān)鍵基因的功能，闡明PrfA