4b型單核細(xì)胞增生李斯特菌InlF蛋白的致病機(jī)制研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是重要的食源性人獸共患李斯特菌病的病原菌。在其多種毒力因子的作用下，Lm能突破宿主的腸道屏障、血胎屏障和血腦屏障進(jìn)行擴(kuò)散和傳播，所引發(fā)的感染具有較高死亡率。在Lm感染宿主的過(guò)程中，能憑借其獨(dú)特的表面蛋白入侵宿主的吞噬細(xì)胞及多種非吞噬細(xì)胞，并在胞內(nèi)存活和增殖。內(nèi)化素蛋白家族是其中一類重要的毒力因子，Lm的黏附侵襲作用與其多種內(nèi)化素蛋白密切相關(guān)，InlF蛋白為內(nèi)化素家

2、族成員，其氨基酸序列在臨床腦膜炎型分離株和食品及環(huán)境分離株間差異較大，但迄今為止尚未對(duì)其功能特性進(jìn)行深入研究。本文以從暴發(fā)李斯特菌病的綿羊腦內(nèi)分離的血清型4b的Lm NTSN菌株的InlF蛋白為研究對(duì)象，以多種非吞噬細(xì)胞及小鼠和豚鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，深入研?b型菌株InlF蛋白的致病作用，為揭示Lm致病機(jī)理提供了新認(rèn)識(shí)。
　　1、Lm內(nèi)化素家族基因體內(nèi)外感染條件下轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性
　　以5種非吞噬細(xì)胞（人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系Caco-2

3、、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC、鼠肝細(xì)胞系BRL3A、鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3）為體外感染模型，BALB/c小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)LmNTSN體內(nèi)外感染后的9種內(nèi)化素基因（inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlF、inlI、inlJ、vip）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，在體外感染條件下，除HBMEC細(xì)胞外， Lm感染非吞噬細(xì)胞系后其inlF、inlI、inl

4、J、vip基因均顯著上調(diào)表達(dá);在體內(nèi)口服感染條件下，內(nèi)化素基因在小鼠及豚鼠脾臟和肝臟中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平趨勢(shì)一致;大腦中內(nèi)化素基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)存在差異，其中inlF、inlI、vip基因僅在豚鼠腦組織中顯著性上調(diào)。以上結(jié)果提示，除小鼠腦組織外，inlF基因在Lm體內(nèi)外感染中發(fā)揮重要作用;此外，還預(yù)示4b型Lm感染小鼠和豚鼠的致病機(jī)制存在一定的差異。
　　2、LmNTSN內(nèi)化素蛋白InlF的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)
　　本研究對(duì)Lm

5、NTSN的inlF基因進(jìn)行了克隆，并對(duì)其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了生物學(xué)信息預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，InlF蛋白是一個(gè)含有亮氨酸重復(fù)區(qū)域(LRRs)和LPXTG結(jié)構(gòu)的細(xì)胞壁表面蛋白，其N(xiāo)末端含有長(zhǎng)為35個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列，13個(gè)LRRs序列在蛋白的高級(jí)構(gòu)象上內(nèi)凹形成口袋狀，與內(nèi)化素InlA蛋白結(jié)構(gòu)相似，C末端的LPXTG結(jié)構(gòu)可被轉(zhuǎn)肽酶A(StrA)識(shí)別切割并共價(jià)結(jié)合于細(xì)胞壁磷壁酸。利用MEGA5軟件對(duì)InlF氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LmN

6、TSN的InlF蛋白與譜系Ⅰ中菌株的InlF蛋白高度同源，而譜系Ⅰ、Ⅱ中菌株的InlF蛋白同源性較低(78％)。利用低溫表達(dá)載體pCold成功地表達(dá)了InlF蛋白，SDS-PAGE結(jié)果顯示，40kDa的目標(biāo)蛋白以包涵體的形式存在。以弗氏佐劑聯(lián)合InlF蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，用間接ELISA方法對(duì)InlF蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的抗InlF血清IgG效價(jià)測(cè)定結(jié)果顯示，血清效價(jià)為1∶800。InlF蛋白的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為其功能研究提供了依據(jù)

7、，該蛋白的原核表達(dá)和多抗的制備為其功能研究提供了生物材料。
　　3、LmNTSN△inlF缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的研究
　　利用同源重組技術(shù)成功地構(gòu)建了inlF基因的缺失突變株LmNTSN△inlF，以五種非吞噬細(xì)胞系為體外感染模型、小鼠和豚鼠為體內(nèi)感染模型，對(duì)其功能進(jìn)行了研究。RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果表明，缺失突變株中的inlF基因不能有效轉(zhuǎn)錄;提取LmNTSN△inlF的菌體蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示

8、抗InlF的多克隆抗體未檢測(cè)到大小為88kDa的靶蛋白，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平證明inlF基因已成功從NTSN基因組中敲除。缺失突變株LmNTSN△inlF的生長(zhǎng)曲線、生理生化特性結(jié)果顯示，inlF基因缺失突變株在BHI液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及代謝特性與野生株相比無(wú)顯著性差異。
　　選用五種人源和鼠源的非吞噬細(xì)胞（人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系Caco-2、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人腦內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC、鼠肝細(xì)胞系BRL3A、鼠成纖維細(xì)胞系NIH3

9、T3）為體外感染模型進(jìn)行細(xì)胞黏附、侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，△ inlF缺失株對(duì)細(xì)胞黏附侵襲的能力與野生株相比無(wú)顯著差異。選取小鼠小腸為體外、體內(nèi)感染模型，對(duì)InlF在早期感染中的作用進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)感染小腸1h時(shí)，△inlF缺失株對(duì)腸道黏附能力均顯著低于野生株（P＜0.05）;在體內(nèi)感染3h和5h時(shí)，△inlF缺失株分別在派伊爾氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中定植，且其在腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株之間存在顯著性差異(P＜0.05)，

10、由此表明InlF蛋白在Lm感染早期的黏附和定植過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　此外，以小鼠和豚鼠為體內(nèi)口服感染模型，對(duì)inlF缺失株在體內(nèi)的感染動(dòng)態(tài)、組織分布和病理變化進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，在小鼠口服感染4h時(shí)，△inlF缺失株在肝臟中的定植數(shù)量顯著低于野生株(P＜0.05)，而脾臟、小腸、腸系膜淋巴結(jié)中的載菌量與野生株相比無(wú)明顯差異;在后期感染中，△ inlF與野生株在這些內(nèi)臟中的定植數(shù)量無(wú)顯著差異?？诜腥倦嗍?h后，△inlF缺失株在

11、脾臟、肝臟中的定植能力顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）;感染24h后，在脾臟、肝臟中的增殖能力均極顯著低于野生株(P＜0.001)。病理切片結(jié)果顯示△ inlF缺失株對(duì)豚鼠的毒力明顯低于野生株。由此可知，與小鼠感染模型相比，InlF蛋白在Lm感染豚鼠后突破腸道屏障并在脾臟、肝臟中的定植和致病中發(fā)揮更加重要的作用。
　　綜上所述，對(duì)譜系Ⅰ的4b型菌株LmNTSN的InlF蛋白功能研究結(jié)果表明， InlF蛋白對(duì)Lm突破小鼠和豚鼠