甜瓜TILLING平臺的構(gòu)建及多壁碳納米管與過氧化氫酶互作的研究.pdf

1、本論文分為兩部分，第一部分為甜瓜TILLING平臺的構(gòu)建，第二部分為多壁碳納米管與過氧化氫酶互作的研究。
　　 甜瓜TILLING平臺的構(gòu)建:
　　 隨著測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的動植物完成了全基因組的測序，科學(xué)家們的研究重點(diǎn)逐漸從基因組測序轉(zhuǎn)移到基因功能的闡釋上來。傳統(tǒng)反向遺傳學(xué)的研究手段，能夠闡釋基因的功能，但是它們依賴轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在轉(zhuǎn)基因體系不成熟的物種中很難應(yīng)用。定向誘導(dǎo)基因組局部突變(TILLING)技術(shù)，是一

2、種不依賴轉(zhuǎn)基因的全新反向遺傳學(xué)研究手段，結(jié)合化學(xué)誘變劑和高通量的篩選技術(shù)，目前已經(jīng)成功地應(yīng)用于動植物基因功能的研究。
　　 甜瓜是世界上一種重要的蔬菜作物，近年來，越來越多甜瓜基因組學(xué)的信息被挖掘了出來，尤其是甜瓜全基因組測序項(xiàng)目的完成，使它的研究重點(diǎn)逐漸進(jìn)入了后基因組學(xué)的時代。但是，傳統(tǒng)反向遺傳學(xué)手段限制了甜瓜基因功能的研究，因而在本研究中，以冬甜瓜（Inodorus melon）Piel de Sapo為材料，構(gòu)建了TILL

3、ING的研究平臺，希望為甜瓜提供一個有力的反向遺傳學(xué)工具，本研究的主要內(nèi)容為以下幾個方面:
　　 1.EMS誘變?nèi)后w的構(gòu)建及表型變異的調(diào)查
　　 本研究以Piel de Sapo DH系的M62-113為野生型親本材料，選用0.5％，1％和1.5％的甲基磺酸乙酯(EMS)濃度做預(yù)備實(shí)驗(yàn)，根據(jù)M2代種子的發(fā)芽率和植株在田間的生命力，最終選用1％的EMS濃度作為大群體的誘變濃度，構(gòu)建了包含2368個M2家系的EMS群體。經(jīng)過

4、性狀調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甜瓜的EMS群體中包含大量的突變體。約有5％的家系發(fā)生了子葉的改變;約有4.3％的家系為侏儒株或者半侏儒株;2.1％的M2家系出現(xiàn)了黃化或者白化現(xiàn)象;2％的M2家系在莖和葉的形態(tài)上發(fā)生了改變。
　　 2.TILLING體系的建立及突變位點(diǎn)的篩選
　　 在甜瓜TILLING平臺的建立試驗(yàn)中，2368個M2家系形成了592個4倍池用于分析。4個與果實(shí)成熟相關(guān)的基因在群體中篩選得到9個突變位點(diǎn)，其中，Cm-NOR

5、基因沒有篩選到突變位點(diǎn);Cm-ACO1、Cm-DET1和Cm-DHS分別篩選到基因篩選1、5、3個突變位點(diǎn)，產(chǎn)生突變的家系分別為C142;I76、F201、F1876、C487和F1248;F1728、C348和C519。序列分析表明，家系C142、F201、F1876、F1728、C348和C519發(fā)生錯義突變，I76發(fā)生同義突變，C487和F1248的突變發(fā)生在非編碼區(qū)。
　　 3.突變家系的表型分析
　　 對錯義突

6、變的6個M2家系做表型分析，結(jié)果表明Cm-NOR、Cm-ACO1、Cm-DET1和Cm-DHS的突變體沒有發(fā)生目標(biāo)性狀的可辨改變。其中，家系C519測序分析沒有檢測到突變株，這一結(jié)果表明家系C519的突變可能為假陽性。因而，在果實(shí)成熟的基因中共檢測到8個突變位點(diǎn)。除了與果實(shí)成熟相關(guān)的基因以外，在本研究中，還對基因Cm-PDS的突變家系C384和Cm-eIF4E的突變家系F57和F2036做了表型分析。Cm-PDS基因與類胡蘿卜素合成相關(guān)

7、，C384的純合突變株出現(xiàn)白化現(xiàn)象，與擬南芥PDS基因突變體的表型一致，驗(yàn)證了Cm-PDS基因的功能。純合突變株的表型變化與Cm-PDS基因功能相關(guān)，表明TILLING技術(shù)是甜瓜反向遺傳學(xué)研究的有效工具。
　　 4.甜瓜PieldeSapoEMS突變?nèi)后w的評價
　　 在甜瓜PieldeSapo的TILLING平臺中，選用7個基因Cm-NOR、Cm-ACO1、Cm-DET1、Cm-DH、Cm-eIF4E、Cm-eIFI(i

8、so)4E和Cm-PDS（共12個片段）在EMS誘變?nèi)后w中篩選到14個突變位點(diǎn)，對甜瓜PieldeSapoTILLING平臺的突變頻率進(jìn)行計(jì)算，得出突變頻率約為～1/1.5Mb。這個突變密度與目前已經(jīng)建立TILLING平臺的物種比較，處于中間水平。
　　 本研究，首次嘗試在冬甜瓜(Inodorus melon)甜瓜PieldeSapo中構(gòu)建在TILLING平臺，由于經(jīng)驗(yàn)不足，文獻(xiàn)依據(jù)不多，最終得到突變?nèi)后w的效率處于中等水平。但是

9、，本平臺的構(gòu)建，能夠用于甜瓜的后基因組學(xué)的研究，研究結(jié)果能夠?yàn)闃?gòu)建高效的甜瓜TILLING平臺提供依據(jù)。
　　 多壁碳納米管與過氧化氫酶互作的研究:
　　 碳納米管是現(xiàn)代納米材料中性能獨(dú)特、應(yīng)用前景廣闊的新型材料。它易于制備，易于生物修飾的優(yōu)點(diǎn)，使其在生物學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，關(guān)于碳納米管的生物學(xué)效應(yīng)缺乏深入系統(tǒng)的研究，碳納米管與生物大分子的作用機(jī)理仍然不夠清晰。
　　 在碳納米管大量應(yīng)用的同時，它的安

10、全性問題也引起了廣泛的關(guān)注。目前，“氧化應(yīng)激學(xué)說”是碳納米管引起生物毒性，被普遍接受的一個原因。在本研究中，選用與氧化應(yīng)激緊密相關(guān)的酶之一過氧化氫酶為靶蛋白，利用透射電鏡、紅外光譜、圓二色性光譜、紫外-可見吸收光譜及熒光光譜等技術(shù)或手段從不同角度研究了碳納米管與過氧化氫酶的作用機(jī)理，一方面能夠?yàn)樘技{米管與功能蛋白質(zhì)在分子水平上作用的機(jī)理提供一定的數(shù)據(jù)參考;另一方面也能為闡釋碳納米管引起氧化應(yīng)激現(xiàn)象，提供新的思路。本論文的主要研究內(nèi)容為以

11、下幾個方面:
　　 1.透射電鏡的表征，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶有效地結(jié)合在碳納米管的外壁上，吸附飽和值約為40mg過氧化氫酶/100mg碳納米管;兩者的吸附導(dǎo)致了酶活性的降低，抑制率最高達(dá)到45％，這有可能碳納米管導(dǎo)致體內(nèi)毒性的重要原因之一。
　　 2.通過紅外光譜、圓二色光譜的研究，發(fā)現(xiàn)與碳納米管互作后，過氧化氫酶的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，α-螺旋比例從26.7％下降到25.1％，β-折疊由20.7％變?yōu)?3.4％，β-轉(zhuǎn)角由24

12、.6％變?yōu)?2.2％，這些比例變化表明過氧化氫酶的肽鏈骨架可能結(jié)構(gòu)變得松散，分子鏈狀結(jié)構(gòu)展開，內(nèi)部疏水區(qū)域的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸有可能暴露出來。
　　 3.通過紫外-可見吸收光譜的研究，發(fā)現(xiàn)與碳納米管互作后，過氧化氫酶的肽鏈骨架結(jié)構(gòu)變得疏松，蛋白質(zhì)主鏈酰胺鍵的微環(huán)境由原來的較為疏水變?yōu)橄鄬τH水，色氨酸等芳香族氨基酸也因兩者的結(jié)合而暴露出來。
　　 4.通過熒光光譜的研究，發(fā)現(xiàn)與碳納米管互作后，過氧化氫酶的熒光信號

13、發(fā)生了猝滅，根據(jù)Stern-Volmer方程曲線和熒光壽命的檢測斷定這種猝滅為靜態(tài)猝滅，說明碳納米管與過氧化氫酶形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。同步熒光光譜的結(jié)果表明兩者的結(jié)合為非特異性結(jié)合。
　　 5.選用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法，計(jì)算出碳納米管與過氧化氫酶的熒光基團(tuán)（色氨酸）之間的平均距離為2.98nm，這個距離說明兩者之間具備發(fā)生相互作用以及能量轉(zhuǎn)移的條件。
　　 本研究在分子水平上全面分析碳納米管與過氧化氫酶的相互作用，建立了