雞蛋清卵粘蛋白的純化、增溶及抗感染活性研究.pdf

1、粘蛋白是生物機(jī)體內(nèi)最古老的防御體系的重要成分之一，在眾多生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。然而幾乎所有粘蛋白目前已知的功能均是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的，對(duì)禽蛋中粘蛋白的研究相對(duì)較少。本文以雞蛋蛋清中的粘蛋白(ovomucin)為研究對(duì)象，以ovomucin的結(jié)構(gòu)與功能為核心，在純化出高純度和高活性蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，研究了提高ovomucin溶解性的方法，并對(duì)其體外抗菌、抗病毒感染的活性與生化機(jī)制開(kāi)展了系列研究工作。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:

2、r>　　 首先采用分步等電點(diǎn)鹽析結(jié)合凝膠過(guò)濾色譜法從雞蛋清中分離純化ovomucin，其過(guò)程為:50 mmol/L CaCl2溶液制備較高含量的ovomucin，后用50 mmol/L MgCl2進(jìn)一步除去溶菌酶，再經(jīng)Sephacryl S-300 HR凝膠過(guò)濾法純化，進(jìn)樣體積為2 mL，洗脫液為含0.05 mol/L MgCl2的Tris-HCl(20 mmol/L pH8.4)，流速為0.5 mL/min。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明所得蛋白

3、質(zhì)為ovomucin，不含其它蛋白質(zhì)肽段信息。HPLC和SDS-PAGE分析結(jié)果顯示其純度為99.13％。采用此方法制備的ovomucin終產(chǎn)率為(57.03±1.22)％，總回收率為(40.87±0.76)％。純化后的ovomucin對(duì)新城疫病毒(NDV)LaSota株的半數(shù)抑制濃度(IC50)為5.78±0.09μg/mL。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)結(jié)果表明低濃度MgCl2可以顯著提高ovomucin對(duì)NDV的粘附能力(P＜0.

4、05)。氨基酸分析顯示獲得的ovomucin富含Ala，Thr, Pro和Val，具有典型的粘蛋白特性，同時(shí)含有較多硫酸基、唾液酸、糖醛酸和己糖，具有作為抗菌抗病毒研究的潛在結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 研究了提高ovomucin溶解性的方法與機(jī)制。溶解性測(cè)定結(jié)果表明，水不溶性ovomucin在1 mol/L精氨酸中溶解度為(21.14±1.47)％，是其在蒸餾水(1.96％)中的10倍以上。熒光猝滅實(shí)驗(yàn)表明精氨酸在低濃度時(shí)通過(guò)靜電作用與o

5、vomucin形成靜態(tài)復(fù)合物，二者在不同溫度下結(jié)合常數(shù)Ka分別為:3.282 L.mol-1(298K)、2.404 L·mol-1(308K)和1.904 L·mol-1(313K)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為1.141(298K)、1.130(308K)和1.118(313K)。電導(dǎo)法和芘熒光探針實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精氨酸濃度小30 mmol/L時(shí)主要通過(guò)靜電作用與ovomucin結(jié)合，未引起ovomucin結(jié)構(gòu)的顯著變化;精氨酸濃度在30-10

6、0 mmol/L時(shí)，復(fù)合體中出現(xiàn)大量疏水微區(qū)。ANS和FT-IR分析結(jié)果表明，在精氨酸濃度大于100 mmol/L以后，ovomuicn二級(jí)結(jié)構(gòu)中的無(wú)規(guī)則卷曲增加，折疊結(jié)構(gòu)及螺旋結(jié)構(gòu)減少，分子間聚集程度減弱，ovomucin的表面疏水性顯著降低。粘附試驗(yàn)結(jié)果表明，添加100 mmol/L精氨酸并未導(dǎo)致ovomucin對(duì)NDV粘附活性的顯著降低(P＞0.05)，因此可以應(yīng)用精氨酸實(shí)現(xiàn)ovomucin的非變性有效增溶。
　　 測(cè)定了

7、ovomucin的抗菌活性及其對(duì)環(huán)境條件的穩(wěn)定性。結(jié)果表明:ovomucin對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌最小抑菌濃度分別為0.05 mg/mL和0.4 mg/mL，相應(yīng)的抑菌率分別為（61.23±6.5）％和（34.34±4.4）％，而對(duì)金黃色葡萄球菌則無(wú)明顯抑制作用。細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.05 mg/mL的ovomucin可以有效抑制大腸桿菌的增殖，但其僅能延緩沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。粘附試驗(yàn)結(jié)果表明，ovomucin對(duì)三種細(xì)菌均具有

8、一定的粘附能力，ovomucin濃度由2.5μg/mL增大到30μg/mL時(shí)，其對(duì)大腸桿菌的粘附率由19.3％升高到64.4％，對(duì)沙門氏菌的粘附率由22.1％升高到68.3％，對(duì)金黃色葡萄球菌的粘附率由16.3％升高到68.5％，但相同粘度的ovomucin對(duì)不同細(xì)菌粘附效率之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。不同pH處理對(duì)ovomucin抗菌活性影響顯著(P＜0.05)，在酸性條件下ovomucin對(duì)大腸桿菌的抑制率較低，隨著pH升高抑

9、菌率增大，在pH7-9條件下對(duì)大腸桿菌的抑制效果最好。Ovomucin的抗菌活性對(duì)溫度具有較好的耐受性，即使經(jīng)100℃處理10 min，ovomucin對(duì)大腸桿菌的抑菌率仍可達(dá)60％以上。
　　 在建立ovomucin抗病毒模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞病變程度、細(xì)胞存活率、病毒抑制率以及血凝抑制等指標(biāo)，評(píng)價(jià)ovomucin對(duì)流感病毒H5N1、H1N1以及新城疫病毒LaSota、Ⅴ-4和Ⅳ系的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ovomucin對(duì)五株不同

10、毒株均具有一定的抑制效果，與病毒混合后能明顯降低病毒感染力，0.25 mg/mL的ovomucin對(duì)H5N1、H1N1以及新城疫病毒Ⅱ、Ⅴ-4和Ⅳ系的血凝抑制率分別為(72.89±6.02)％、(64.29±7.94)％、(71.15±6.41)％、(60.32±9.16)％和(74.26±7.35)％。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ovomucin對(duì)H5N1早期吸附進(jìn)入細(xì)胞的抑制效果最好，0.25 mg/mL的ovomucin對(duì)H5N1在MDCK細(xì)胞上

11、的病毒抑制率為77.85％。不同來(lái)源粘蛋白對(duì)H5N1的抗病毒活性存在差異，ovomucin的對(duì)H5N1的抑制效果高于牛下頜腺粘蛋白，但是略低于豬胃粘蛋白。
　　 為進(jìn)一步探討ovomucin抗H5N1的生化機(jī)制，通過(guò)改變加藥方式，從體外細(xì)胞水平的抗病毒作用環(huán)節(jié)結(jié)合直接顯微觀察探討ovomucin體外抗流感病毒的作用環(huán)節(jié)，結(jié)果表明ovomucin抗病毒作用是通過(guò)抑制病毒感染細(xì)胞早期的吸附或進(jìn)入過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。血凝實(shí)驗(yàn)和神經(jīng)氨酸酶抑制實(shí)

12、驗(yàn)結(jié)果證明ovomucin主要通過(guò)抑制H5N1表面血凝素(HA)識(shí)別細(xì)胞的過(guò)程達(dá)到抑制病毒侵染的目的，同時(shí)ovomucin也起到一定的保護(hù)細(xì)胞作用。ELISA和雙偏振極化干涉測(cè)量(DPI)結(jié)果表明ovomucin可以與HA抗原發(fā)生有效結(jié)合;DPI實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析ovomucin與H5N1表面HA的相互作用過(guò)程，發(fā)現(xiàn)二者以嵌入式的方式發(fā)生結(jié)合。因此ovomucin抗H5N1感染的機(jī)制為:ovomucin與HA通過(guò)嵌入式結(jié)合，抑制HA對(duì)MDC

13、K細(xì)胞受體的識(shí)別，從而影響H5N1侵染早期對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和侵入，進(jìn)而抑制病毒增殖，在這個(gè)過(guò)程中還伴隨著ovomucin和宿主細(xì)胞表面發(fā)生相互作用來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受病毒侵染的過(guò)程。
　　 采用傅里葉變換紅外光譜法和二維相關(guān)分析技術(shù)研究了ovomucin構(gòu)象轉(zhuǎn)變與溫度之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，25-95℃升溫過(guò)程中ovomucin分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化次序依次為:α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角，無(wú)規(guī)卷曲。Ovomucin構(gòu)象在pH8.4-9.0

14、之間有中間體存在。紅外光譜擬合結(jié)果表明低濃度Mg2+與ovomucin糖基結(jié)合，未造成ovomucin二級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著改變。而高濃度Mg2+會(huì)影響ovomucin的肽骨架及其空間構(gòu)象，使ovomucin的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)減少，β-轉(zhuǎn)角和β-折疊結(jié)構(gòu)增加。動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果表明添加0.1倍質(zhì)量濃度的Mg2+可以使0.5 mg/mL的ovomucin的平均粒度由60.23nm下降到51.39nm，說(shuō)明Mg2+的加入會(huì)使ovomucin的分子結(jié)構(gòu)變得

15、更為緊密。pH誘導(dǎo)ovomucin構(gòu)象與活性的分析結(jié)果表明，隨著溶液中β-轉(zhuǎn)角含量由20.7％增加到39％，ovomucin對(duì)H5N1血凝的抑制率也相應(yīng)由53.9％提高到73.1％，Mg2+對(duì)ovomucin結(jié)構(gòu)與功能的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入Mg2+以后，ovomucin二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角含量由19.11％增加到22.96％，相應(yīng)的對(duì)病毒的粘附率可以由30％左右提高到68.9％。上述結(jié)果說(shuō)明ovomucin結(jié)構(gòu)有序性和緊密程度越高，其抗病