草魚脂代謝相關(guān)酶的分離純化、分子克隆、酶動力學(xué)性質(zhì)及對銅和鋅的響應(yīng)研究.pdf

1、草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要養(yǎng)殖魚類之一。2011年產(chǎn)量達(dá)到420萬噸(FAO，2012)。隨著草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，各種病癥的頻發(fā)，特別是與脂代謝相關(guān)的疾?。ㄖ靖尉C合癥），嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本論文以具有重要經(jīng)濟價值的草魚為研究對象，以與脂代謝關(guān)鍵酶(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ))為研究重點，借助蛋白水平（酶學(xué)動力學(xué)特性）和分子水平（克隆、結(jié)構(gòu)分

2、析和組織表達(dá)）的手段，擬對草魚不同組織和不同發(fā)育期的關(guān)鍵酶進行研究，同時從脂代謝相關(guān)酶的酶活性及其基因表達(dá)水平研討了礦物元素銅和鋅與脂代謝的關(guān)系。
　　1.草魚G6PD的分離純化及其動力學(xué)性質(zhì)的研究
　　本研究從草魚肝胰臟中通過2'，5'-ADP-瓊脂糖4B親和層析和DEAE瓊脂糖離子交換層析分離純化G6PD，并研究了該酶學(xué)的分子量、最適溫度、最適pH和堿性條件下的穩(wěn)定性、動力學(xué)參數(shù)以及金屬離子對酶活性的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，純化

3、后G6PD最終酶活性為18U/mg蛋白，純化倍數(shù)為1066，最終純化回收率為19.5％，亞分子量為71.85kDa。G6PD的最適溫度為42℃，最適pH值為7.5和9.0。底物G6P和NADP+米氏常數(shù)(Km)值分別為0.026和0.0068mM。底物G6P和NADP+的最大反應(yīng)速率(Vm)值分別為2.20和2.27μM min-1 mg protein-1。底物G6P和NADP+的催化效率分別為0.085和0.334×10-6 min

4、-1 mg protein-1。金屬離子對純化后G6PD活性研究表明，金屬離子Zn+2、Al+3、Cu+2和Cd+2對G6PD的IC50值分別為0.42、0.54、0.94、1.20和4.17mM;金屬離子Zn+2、Al+3、Cu+2和Cd+2對G6PD的抑制常數(shù)Ki值分別為0.52、1.12、0.26和4.8mM。Zn+2、Al+3和Cd+2對G6PD的抑制為競爭性抑制，銅對其為非競爭性抑制。
　　2.草魚CPTⅠ cDNA的克

5、隆與表達(dá)的研究
　　在本研究中成功克隆獲得了草魚3個CPTⅠα構(gòu)型(CPTⅠα1a、CPTⅠα1b和CPTⅠα2a)和1個CPTⅠβ構(gòu)型。對其分子結(jié)構(gòu)和功能進行了預(yù)測和分析，并且檢測了它們的組織表達(dá)模式。通過將我們所獲得的CPT I4種氨基酸序列和其他魚類及哺乳動物進行比對，發(fā)現(xiàn)某些重要性的氨基酸殘基發(fā)生了突變或者替換。如Val19、Leu23和Ser24位點。比對發(fā)現(xiàn)存在2個肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶位點(氨基酸殘基區(qū)域為171-186和4

6、50-477);多個蛋白翻譯修飾位點:天冬酰胺糖基化位點Asn312;乙?；稽cAla2;絡(luò)氨酸磷酸化位點Thr313、Thr603和Tyr720;絲氨酸磷酸化位點Ser24、Ser38、Ser740和Ser748。此外，用TMpred軟件預(yù)測了4種CPTⅠ的跨膜域。結(jié)果表明，草魚存在著2個不同的跨膜域(TM1和TM2)，推測上述氨基酸的替換或突變以及跨膜域的不同可能部分解釋了不同CPTⅠ構(gòu)型對M-CoA的敏感性。
　　同時，分析

7、了草魚4種CPTⅠ構(gòu)型在肝臟、腦、鰓、心臟、白肌、紅肌、脾臟、腎臟、腸系膜脂肪和腸道等組織中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果表明，草魚4種構(gòu)型在不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平有差異。CPT Iα1a和CPTⅠβ傾向于在心臟中表達(dá)，CPTⅠα1b和CPTⅠα2a的mRNA水平在肝臟中表達(dá)最高。
　　3.草魚CPTⅠ動力學(xué)性質(zhì)的研究
　　本研究中，為探究草魚CPTⅠ的酶動力學(xué)性質(zhì)，首先通過差速離心方法從草魚肝臟、心臟、肌肉、脾臟和腸道等

8、組織中分離線粒體并檢測其完整性，再運用酶動力學(xué)的研究手段，對CPTⅠ的酶學(xué)性質(zhì)進行研究。在研究酶動力學(xué)前，對CPTⅠ的最適反應(yīng)條件進行了測定;分析了雙底物在不同濃度下草魚的不同組織中CPTⅠ酶活力的變化。結(jié)果表明，草魚各組織中CPTⅠ酶活力與底物濃度變化滿足底物飽和曲線，符合Michaelis-Menten模型。為此測定其使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，計算得出草魚不同組織中CPTⅠ酶催化的底物動力學(xué)參數(shù)(Km、Vm和催

9、化效率Cat)，底物L(fēng)-carnitine的Km值在腸道中最大;底物L(fēng)-carnitine的Vm值在不同組織中的大小為心臟＞腸道=肝臟＞脾臟＞肌肉。催化底物P-CoA的Km值在心臟中最小，在肌肉中最大;催化底物P-CoA而言，Vm值在不同組織中的大小為心臟＞腸道=肝臟=脾臟＞肌肉。L-carnitine的催化效率Cat在心臟中較高，在腸道中較低;而底物P-CoA的催化效率Cat在心臟中較高，在肌肉中較低?？傊?，草魚組織中的CPTⅠ酶動力

10、學(xué)差異可能反映了脂肪酸氧化能力的強弱。同時，也反映了草魚CPTⅠ酶動力學(xué)組織的特異性。
　　4.草魚不同發(fā)育期肉堿組成和CPTⅠ酶動力學(xué)研究
　　本研究對4個發(fā)育期的草魚肝胰臟和肌肉組織中肉堿組成和CPTⅠ的動力學(xué)性質(zhì)進行了研究。結(jié)果表明，肝胰臟中總?cè)鈮A(TC)含量在出膜和1月齡時水平最高，3月齡時最低，TC含量隨著發(fā)育階段發(fā)生變化。3月齡時草魚肝胰臟中游離肉堿(FC)的水平最低，暗示大部分FC在這個階段發(fā)生了乙酰化(AC)

11、。在肌肉中，TC含量在出膜至3月齡時下降，然后上升至6月齡。AC/FC值是表征機體肉堿代謝變化的重要指標(biāo)，肝胰臟中AC/FC在1月齡時值最大，在出膜時最小。而在肌肉中，AC/FC在3月齡時有最大值，1月齡時有最小值。AC/FC在不同組織中和同一組織不同發(fā)育階段的差異性，暗示了代謝不同生理狀態(tài)和能量的需求。在肝胰臟中，最大反應(yīng)速率Vm從出膜至1月齡顯著性增加，再逐漸降低至6月齡。在肌肉組織中，Vm在1月齡時有最大值，約為出膜時的2倍。在肝

12、胰臟和肌肉組織中米氏常數(shù)Km在1月齡時有最大值。肉堿濃度（TC、AC和FC）在3月齡時含量最低，而在其他發(fā)育期肝胰臟和肌肉組織中濃度均保持恒定。哺乳動物和魚類在FC/Km之間表現(xiàn)出不同特性，可能是由于CPTⅠ調(diào)節(jié)機制的差異。FC濃度在檢測組織中4個發(fā)育期均低于各個的米氏常數(shù)Km值，暗示草魚飼料中需要添加肉堿保證CPTⅠ活性不受肉堿濃度限制。
　　5.水體銅暴露對草魚生長、脂肪沉積和脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響
　　設(shè)置

13、4個不同銅水平（control、0.058、0.150和0.199 mg/l）對草魚進行14天的暴露實驗，研究水體銅對草魚生長、脂肪沉積和脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響。結(jié)果表明，水體銅暴露降低了魚體肝胰臟和肌肉組織脂肪含量、抑制了生長并增加組織中銅的沉積。在檢測組織中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(6PGD)、異檸檬酸脫氫酶(ICDH)、蘋果酸脫氫酶(ME)和脂肪酸合成酶(FAS)酶活性及其基因mRNA

14、表達(dá)水平隨水體銅濃度增加而降低。水體銅暴露下調(diào)了脂肪甘油三脂脂肪酶(ATGL)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1(SREBP-1c)和過氧化物酶增殖體激活受體(PPARα) RNA表達(dá)水平。水體銅暴露誘導(dǎo)了脂肪合成和分解相關(guān)酶的酶活性及基因mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，這主要通過抑制脂肪生成這一主要矛盾來降低組織中脂肪的含量。
　　6.水體鋅暴露對草魚生長、脂肪沉積和脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響
　　設(shè)置

15、4個不同鋅水平（control、0.85、2.20和3.10 mg l-1）對草魚進行14天的暴露實驗。研究水體鋅對草魚生長、脂肪沉積和脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響。結(jié)果表明，水體鋅暴露顯著性增加了肝胰臟中脂肪沉積、降低了肌肉組織脂肪沉積、抑制了生長和增加了組織中鋅的含量。在肝胰臟中，水體鋅暴露上調(diào)了脂肪合成相關(guān)酶（G6PD、6PGD、ICDH、ME和FAS）酶活性及其相關(guān)基因(G6PD、6PGD、ME、FAS和SREBP-1c)

16、 mRNA的表達(dá)，而下調(diào)了CPTⅠ酶活及脂肪分解相關(guān)基因（如PPARα、CPTⅠα1a、CPTⅠα2a和HSL）的mRNA表達(dá)。在肌肉中，隨著水體鋅濃度的升高，CPTⅠ酶活性及分解相關(guān)基因(如PPARα、HSL和ATGL)表達(dá)升高，而脂肪合成相關(guān)酶(G6PD、ICDH、ME和FAS)活性及相關(guān)基因(G6PD、6PGD、ME、FAS和SREBP-1c) mRNA的表達(dá)下降。并對SREBP-1c和PPARα與脂肪生成酶和分解酶活性及其表達(dá)進